植物细胞培养

5) 悬浮培养
• 将一定密度的悬浮细胞接种于液体培养基
中,在保持良好的分散状态下培养. 适宜于消 化得到的细胞数充足的情况下使用。
悬浮培养
4.4.4.3 细胞的同步化
• 细胞同步化：指同一培养体系的所有细胞都同时
通过细胞周期的某一特定时期。
• 有饥饿法，抑制法和冷处理法等。
可以通过饥饿法获得G1或G2期同步化细胞。
芦荟的愈伤组织培养 消毒处理 幼苗茎尖 接种培养形成愈 MS+（1-6mg/L)BA+ 伤组织
(0.1-0.5mg/L) NAA
MS+（2-4mg/L)BA+ (0.1-0.5mg/L) NAA
生芽培养
继代培养
MS+ (0.1-0.5mg/L)IBA+ （2-5mg/L)PP333
生根培养
基质：河砂∶珍珠岩（1∶1）
炼苗移植
炼苗
4.3.5 植物器官培养
• 定义：指将植株上的各种器官从母体上分离出
来，放在无菌的人工环境让其进一步发育，最终 长成幼苗的过程。 植物器官主要包括：毛状根，芽，体细胞胚等 植物器官培养技术与植物组织培养技术基本一致。
4.3.6 植物组织培养的应用：
• 1.无性繁殖系快速繁殖 • 2.获得无病毒植株 • 3.新品种育种 • 4.在遗传、生理、生化和病理研究上的应用 • 5.种质资源保存与创新 • 6.产业化生产：花卉，果蔬脱毒
pH值（5.8） 琼脂
ห้องสมุดไป่ตู้
• 封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封
口，培养皿用无菌胶带封口 • 温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%） • 增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分 株或切段转入增殖培养基中继代培养。
5）愈伤组织的生成
• 成熟细胞经脱分化等一系列过程，产生一
团不定型的疏散排列的薄壁细胞---愈伤组 织。 • 植物愈伤组织的芽和根的分化由生长素和 细胞分裂素的浓度及比例决定的。当生长 素浓度大于细胞分裂素浓度时，愈伤组织 分化根，反之则形成芽。
定义 :指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 基本技术: （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固 体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块活跃生长 的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组 织块上放一片已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤 纸上。 （4）恒温培养1-3月。
（也称植板率）。
• 植板率: 已形成细胞团的百分数（即每100个铺在
平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）
优点:
(1)可以定点观察
(2)分离细胞容易 缺点: 培养细胞气体交换不畅， 湿度不够。
固体平板培养图示：
2）看护培养和饲 养层培养
• I 看护培养（nurse
culture）Muir 等 1953年设计。是指 用一块活跃生长的愈 伤组织来看护单个细 胞，使其持续分裂和 增殖。
上，每瓶接种4-10个。
培养基的主要成分： 水 无机成分： 无机大量元素 氮：铵盐、硝酸盐混合
磷：磷酸盐 钾：钾盐 钙、硫、镁
无机微量元素
主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯
有机成分（碳源）：
糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。
植物生长调节物质：
生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT
• 细胞的分离及密度的调整：一般采用酶分离
法，小细胞团不能超过6个细胞，要选择合适 的过滤网筛。 细胞密度一般控制在1000-1×105/ml
• 板的制备和细胞的培养：35℃的固体培养基（1.4%
琼脂）均匀的平铺于培养皿中，厚度5mm左右。
• 接种和培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜
观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率
4.3.7 人工种子
在一定条件下，愈伤组织细胞诱导分化出具 有胚芽，胚根和胚轴的胚状结构—胚状体
定义: 即最外面包裹一层有机薄膜的植物胚 状体 优势： 便于运输和储藏；提高生产效率； 保存珍贵品种
人工种子
外层：固定化膜（有机薄膜），保护胚状体水分， 防止外部力量冲击 中间：营养成分和植物激素 内层：包裹的胚状体或芽
3）双层滤纸培养 在饲养层和靶细胞层之间放两张滤纸,上面 一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继 续培养.
4）微室培养
定义: 将单细胞培养在少量的培养基中培养。
优点： （1）在培养过程中，可 以连续进行显微观察一个细 胞的生长、分裂和形成细胞 团的全部过程.
缺点： （1）培养时间较短. （2） 操作麻烦。
看护培养特点：
优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。 缺点： （1）不能在显微镜下直接 观察细胞的生长过程。
II 饲养层培养：
• 饲养层培养是用处理
过的（X射线处理） 无活性的或分裂很慢， 不具备分裂能力的细 胞来饲养所养的靶细 胞(要培养的细胞）。
红色的细胞为饲养层细胞； 蓝色的为靶细胞
愈伤组织的形成
愈伤组织的分化
1） 培养材料的采集：
• 可以取受精卵，发育中的分生组织（根尖，
茎尖），雌雄配子等。 • 最常用的培养材料是茎尖，通常切块 0.5cm以下，如果是培养无病 毒苗，其长度在0.1mm以下。
外植体（培养材料）选择的原则
• 必须含有活细胞。 • 幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。 • 母株必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。 • 母株必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
4.5.2 原生质体研究意义
研究组织和器官发育机制；
可以进行有关遗传操作；
研究植物细胞的生理功能；
诱导融合形成杂种细胞。
4.5.3 原生质体的制备 原材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化 原生质体活力检测
4.5.3.1 用于分离原生质体的材料来源
两个来源：
各种组织的叶 片，根尖等
愈伤组织
6）组培苗的练苗移栽
• 试管苗进入自然环境前必须进行练苗。 • 将培养容器打开，自然光照3天，取出小
苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好 的基质中。
4.3.4 愈伤组织的形成过程
在接种和培养的过程中涉及到愈伤组织的 形成，生长和分化。愈伤组织形成一般要经 过三个步骤：
1）启动期：指成熟细胞或原生质准备分裂和脱 分化的时期，需要合适的诱导剂：NAA，IAA 等。 2）分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化， 外层细胞，不断分裂、增生子细胞的过程 。 3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞 内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而 使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分 化出形态和功能不同的细胞，分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等 。
4.3 植物组织与器官培养
4.3.1 植物组织培养的定义： 在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
• 不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成 不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。
4.3.3 植物组织培养的基本步骤
• 培养材料的采集 • 培养材料的消毒 • 制备外植体 • 愈伤组织形成 • 根和芽的诱导 • 组培苗的练苗移栽
基本步骤
试管植物的两个核心步骤：一是愈伤组织的 形成，二是愈伤组织的分化
• 有丝分裂抑制法: 在指数生长期的细胞悬浮
培养物加入一定浓度的有丝分裂抑制剂如 秋水仙素4-6小时，作用不可逆的。
4.4.4.4 植物细胞的保存
• 继代培养保存法 • 低温保存法：5-10度 • 冰冻保存法：-20度或液氮中
4.5 原生质体培养
• 原生质体的相关的概念和研究意义 • 原生质体的分离
4.4.4 植物单细胞培养
• 单细胞培养目的主要是观察培养的细胞个
体是如何进行分裂，分化，生长及发育， 同时也为大规模培养奠定基础。 • 单细胞培养的过程中往往也涉及愈伤组织 的形成.
4.4.4.1 单细胞制备方法：
• 机械法：机械磨碎；效率低 • 酶解法：消化植物细胞壁的专一性水解酶
如：纤维素酶，效率高 • 来源于愈伤组织
• •
•
基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞， 进而发育为一个完全相同的生物体。 外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。 愈伤组织：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分 化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄 壁细胞（具有未分化细胞的特性）。 胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚 根和胚轴的胚状结构。
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.4 植物细胞的培养：
• 4.4.1 植物细胞培养定义 • 定义：指在离体条件下，将愈伤组织或其它容易
分散的组织置于培养基中进行培养，得到分散成 游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从 而获得大量细胞群体的一门技术。目的是获得初 级和次级代谢产物。 可通过改变培养基成分及其浓度，生长调节剂的 选择等手段来实现代谢产物的诱导。
•
4.4.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象： 主要有：单细胞培养，单倍体培养（花药雄 性生殖细胞），原生质 根据培养系统： 主要有：固体培养和液体培养。
4.4.3 植物细胞培养的培养基
• 基础培养基有：
MS，B5，N6 。 主要有无机盐， 碳源， 有机氮源，有机酸等构成。 常用的培养基的组成：MS+植物生长激素+椰 子汁
4.5.3.2 酶消化
取材消毒
取植物组织，消毒后去掉表皮，剪碎；
总的原则：健康无病的年幼组织。
2）培养材料的消毒
材料 自来水和蒸 馏水冲洗 酒精中浸泡 30-60秒
无菌水 冲洗3遍
0.01%升汞 （HgCl2)消毒10 分钟
3） 制备外植体
在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片， 剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。
4）接种和培养（愈伤组织的形成， 生长和分化） • 接种：无菌环境下，外植体接种在培养基
• 愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强 。
外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状， 疏松易碎。
诱导愈伤组织形成的条件：
• 植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极
为重要的因素： 包括生长素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂 素（KT，6-BA，ZT）：生长素使用浓度一 般在0.01-10mg/L， 分裂素使用浓度一般 在0.1-10mg/L 其他一些条件：植物生长力、来源、培养基 的种类、培养条件等。
4.4.4.2 单细胞培养
• 平板培养 • 看护培养 • 微室培养 • 双层滤纸培养 • 悬浮培养
适宜于得到的细胞 数目少，细胞比较 珍贵的情况下使用
1) 细胞平板培养
• 平板培养（plating culture)是指将一定密
度的悬浮细胞接种到或混合到一薄层固体培 养基中培养的技术,类似于微生物细胞的平板 培养。
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.2 发展历史和研究意义：
4.2.1 发展历史：自学 4.2.2 研究意义： 具有重要的经济意义
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
• 原生质体培养
4.5.1 关于原生质体的几个重要概念
• 原生质体(protoplast): 指除去细胞壁的细胞或是说
一个被质膜所包围的裸露细胞。
• 亚原生质体（subprotoplast）：在原生质体分离过
程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较 小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞 核或没有细胞核。
第四章 植物组织与细胞培养
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 植物组织培养：指取出机体内组织与细胞，
模拟机体内生理条件，使之在体外生长成组 织或完整植株。 • 植物细胞培养：植物细胞在体外条件下的存 活或生长，不再形成组织，以生产次生代谢 产物为目的。 意义：能够有效地保持优良品种的特性；生 产无病毒种苗，快速繁殖新品种 ；生成药物 成分如紫杉醇等