植物细胞培养
7.2植物细胞培养(4)n-1
9.5 植物细胞培养基
植物生长激素 植物生长素、细胞激动素、 植物生长素、细胞激动素、赤 霉素和脱落酸等四大类。 霉素和脱落酸等四大类。 等四大类 蛋白质水解物、 有机氮源 ： 蛋白质水解物 、 谷氨酰胺或氨基酸 混合物等。 混合物等。 琥珀酸等三羟酸循环的中间产物 琥珀酸等三羟酸循环的中间产物 加入丙酮酸 或者柠檬酸、 丙酮酸， 有机酸 ： 加入 丙酮酸 ， 或者柠檬酸 、 苹果酸和 复合物质：在植物细胞的培养过程中，酶母抽提 复合物质：在植物细胞的培养过程中， 可以作为细胞的生长剂。 可以作为细胞的生长剂。
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9.3 植物细胞培养的应用实例
目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、 食品、化妆品、 目前 ， 植物细胞培养技术已在农业 、 医药 、 食品 、 化妆品 、 香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞 香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。 培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。 培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。
9 植物细胞培养
9.1 植物细胞培养概念
植物细胞培养是在离体的条件下培养植 植物细胞培养是在离体的条件下培养植 是在离体 物细胞的方法。 物细胞的方法。 它是指在离体条件下将愈伤组织或其他 它是指在离体条件下将愈伤组织或其他 易分散的组织置于液体培养基中 置于液体培养基中， 易分散的组织置于液体培养基中，将组 织振荡分散成游离的悬浮细胞 通过继 游离的悬浮细胞， 织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继 代培养使细胞增殖来获得 使细胞增殖来获得大量细胞群体 代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体 的方法。 的方法。
植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养是一种将植物细胞通过人工的方式在无菌条件下进行培养的方法。
它可以用来研究植物生长发育、植物组织和器官的形成、植物代谢产物的生产等。
植物细胞培养的步骤大致分为以下几个步骤：
1. 材料准备：准备需要培养的植物材料，如幼芽、种子、叶片等。
同时准备好无菌培养基、培养器皿和器械。
2. 表皮消毒：将植物材料表皮的细菌和真菌等杂质进行消毒处理，常用的方法有浸泡在含有消毒剂的溶液中，如酒精和次氯酸钠。
3. 组织分离：将消毒后的植物材料进行分离，常用的方法有切碎组织、分离细胞等。
4. 培养基制备：制备无菌的培养基，可以根据具体需求调整培养基的成分，常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
5. 培养：将组织或细胞转移到无菌培养基上进行培养。
可以选择不同的培养条件，如光照条件、温度、激素的添加等。
6. 培养过程中的观察和记录：观察培养物的生长情况，记录细胞的增殖、分化和器官的形成等变化。
植物细胞培养可以应用于植物繁殖、基因转化、抗病性筛选、药物生产等方面。
同时，植物细胞培养也属于一种生物技术手段，可用于保护濒危物种、加速育种进程等。
植物细胞培养
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
植物细胞培养
班级：农学11-2
姓名：徐东阳
概念及发展
植物细胞培养的概念及发展 植物细胞培养的概念
植物细胞培养是指对有力的植物细胞或细胞小聚体 进行立体无菌培养，通过继续代培养使 细胞增殖， 从而获得大量细胞群体的一种技术。
方法
应用
植物细胞培养的发展
1.全能性 （植物学家Hanberlandt根据细胞理论预言。英国人Steward 和法国人Reinert，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中产生了完整的植株， 对植物细胞的全能性给予了科学的证实．） 2.胚培养（E．hanning培养了萝卜的近成熟胚并发育成熟） 3.无毒植 株 （Morel和Martin通过茎尖分生组织培养获得大丽花的无毒植株。） 4.培养基 （B族维生素、生长素IAA、激动素、MS） 5.应用(从科学研究转入生产应用)
植物细胞悬浮培养
游离单细胞方法 培养基 悬浮细胞培养方法 生长测定 同步化处理
培养基
基本培养基：MS、B5、NT、TR、VR、SS、SCN、SLCC等
碳源：蔗糖、葡萄糖、果调节物质：NAA、IAA、2，4-D、6-BA等
悬浮培养方法
分批培养： 分批培养设计 分批培养细胞的增殖 连续培养： 封闭式连续培养 开放式连续培养（化学恒定、浊度恒定）
植物细胞培养的方法 植物细胞培养的概念及发展
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
植物细胞培养的方法
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
茎段优于叶片 帯叶优于不带叶 不同培养基 MS 幼叶 BS幼茎 氮源 硝酸跟含量高促进 铵根含量高抑制 前体饲养 添加抑制剂 添加诱导子 植物生长调节因子 生物反应器 其他（温度、光超声处理，气体组成）
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
第八章——植物细胞培养
4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？
植物细胞培养
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充 分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。 细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类
封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。
开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
二、培养类型和方法
（一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养， 当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细 胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生 化研究常用的培养方法。
1、成批培养法
（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的 养分为细胞耗尽为止。 （2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在 培养基中的均匀分布。 （3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈 现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。 （4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外 进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养 瓶里，继续进行培养。
细 胞 数 目 静止期 缓慢期
直线生长期
对数增长期
延滞期
时间
细胞生长周期
（二）半连续培养
指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液， 并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复 地取得大量、均一的培养细胞，供生物研 究之用。
（三）连续培养
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并 注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分 补充，保持其恒定体积的培养。
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生 长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培 养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间 延长，细胞密度不断增加。
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物细胞培养
植物细胞培养的方法与分类
植物细胞培养的方法
• 固体培养：细胞在固体培养基上进行培养 • 液体培养：细胞在液体培养基中进行培养 • 悬浮培养：细胞在无细胞壁的液体培养基中进行培养
植物细胞培养的分类
04
植物细胞培养实例分析与实践
植物细胞培养在园艺植物中的应用实例
花卉生产
• 通过细胞培养生产花卉，如玫瑰、菊花等 • 提高花卉产量和品质
观赏植物
• 通过细胞培养生产观赏植物，如多肉植物、盆景植物等 • 保护珍稀观赏植物，防止物种灭绝
植物细胞培养在农作物中的应用实例
粮食作物
• 通过细胞培养生产粮食作物，如水稻、小麦等 • 提高粮食产量和品质
• 有性细胞培养：培养生殖细胞，如花粉、胚珠等 • 无性细胞培养：培养体细胞，如叶片、茎段等
植物细胞培养的条件与优化
植物细胞培养的条件
• 无菌：防止微生物污染 • 营养：提供必需的营养物质，如氮素、磷素等 • 恒温：维持适宜的温度，如25℃ • 恒湿：维持适宜的湿度，如80%
植物细胞培养的优化
• 选择合适的培养基：根据细胞类型和培养目的选择合适的培养基 • 调节光照：提供合适的光照强度和光周期 • 添加植物生长调节剂：如生长素、细胞分裂素等
DOCS
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
解决方案
• 采用无菌技术，防止微生物污染 • 优化培养条件，提高细胞生长和产物合成的效率
植物细胞培养技术的发展趋势与展望
技术创新
• 研究和应用新型培养技术，如基因编辑、细胞信号调控等 • 推动植物细胞培养技术的创新发展
植物细胞培养
（2）气升式反应器
●在反应器环流管底部有一个空气喷嘴，空 气以高速度（250-300m/S）喷入环流管， 气泡被分散于环流管液体中 ●借助于环流管内气-液混合物密度与反应主 体密度之差，气-液混合物连续循环流动。 ●培养罐液体中的溶解氧会不断减少，通过 环流管又达到饱和。
（一）植物单细胞的获得
1、从外植体直接分离单细胞
●外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过
一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬 浮液。 ●悬浮液中所含的完整细胞数量很少， 分散性较好，可以看作是游离的单细胞悬 浮液。
2、从愈伤组织分离单细胞
1）经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织 的薄壁细胞团。 2）将细胞团转移到液体培养基中，进行振 荡培养，使细胞团分散成为单细胞，然后用 适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去细胞团和 残渣，得到单细胞悬浮液。
2．低温处理法
1) 将收集得到的细胞或小细胞团，在4℃左右 的低温条件下处理1～3d，植物细胞在低温 下全部停止生长繁殖， 2)然后再悬浮于新鲜的液体培养基中，在25℃ 培养，于是细胞几乎同时开始生长繁殖，处 于同步状态。
3．限制营养处理法
1)将细胞或小细胞团悬浮在营养物质受到限 制的培养液中培养几天，由于营养缺乏， 细胞的生长繁殖受到限制，几乎所有的细 胞都停止生长； 2)然后再将细胞转移到新鲜的培养液中，进 行悬浮培养，则细胞几乎同步地开始生长繁 殖。
1. 平板培养法
●概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定
的细胞密度，接种在1mm的薄层固体培养基 上进行培养，称之为平板培养。
●由Bergman1960年首创的，其目的是
为了获得单细胞系 ，并研究其生理 生化和遗传上的规律。
特
• 自一个单细胞。 •
植物细胞培养
植物细胞培养植物细胞培养是一项重要的生物学研究技术，通过将植物细胞放入适宜的培养基中，提供适宜的养分和生长条件，使其在无菌条件下进行繁殖和生长。
这项技术在植物生物技术和植物育种研究中有着广泛的应用，可以用于植物组织培养、植物再生、基因工程、植物病毒研究等方面。
接下来，我将详细介绍植物细胞培养的原理、步骤、方法及其应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理是利用植物细胞的分裂和再生能力，在培养基上形成功能完整的植株。
培养基中提供的养分和生长因子可以满足植物细胞的营养需求，而适宜的温度和光照条件则有利于细胞分裂和再生。
在无菌条件下进行培养，可以避免外界的微生物污染和干扰，保证细胞培养的成功率。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养主要包括材料准备、杀菌、建立无菌培养条件、组织处理、细胞培养和植株再生等步骤。
1.材料准备：选择适宜的植物材料，如幼苗的茎尖、子叶、胚乳、花药等作为外植体。
同时准备培养基、培养器具和培养条件所需的试剂和设备。
2.杀菌：将外植体浸泡在含有杀菌剂的溶液中，进行表面消毒，以去除外植体表面的细菌和真菌。
3.建立无菌培养条件：在无菌操作台上进行操作，使用无菌培养器具和培养基，保持操作环境的无菌状态。
4.组织处理：将外植体切割成适当的大小，要求每个组织片段都含有足够的细胞和组织分化能力。
5.细胞培养：将组织片段放置在含有适宜濃度的培养基中，提供适宜的养分和生长因子，调节温度和光照条件，使细胞进一步分裂和分化。
6.植株再生：当细胞分裂和分化达到一定程度时，可以通过调节培养基的成分和添加适宜的激素来诱导细胞形成胚乳、芽和愈伤组织，最终形成功能完整的植株。
三、植物细胞培养的方法植物细胞培养可以通过不同的方法来实现，包括愈伤组织培养、悬浮细胞培养、胚愈伤组织培养等。
1.愈伤组织培养：将外植体的某些部位培养在含有适宜生长因子的培养基上，刺激组织的分裂和分化，形成愈伤组织，进而形成植株。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在液体培养基中，进行无瓶培养。
植物细胞培养技术进展
植物细胞培养技术进展一、植物细胞培养技术概述植物细胞培养技术是指在体外培养的条件下，利用植物细胞分化分裂的特性，通过外部的生长因子、激素、营养物质等丰富的培养环境，控制植物细胞的生长、分裂、形态和多样性，从而达到对植物细胞的组织、器官、植株等形态进行可控制的造型和控制形态生成的目的。
目前植物细胞培养技术已经应用广泛，包括植物种质资源保存、新品种培育、基因工程等方面。
二、1. 精细化控制培养环境当前植物细胞培养技术最大的问题就在于培养环境的建立与控制，由于植物生理生化的复杂性，常规的培养环境难以满足植物细胞不同阶段的需求，因此需要建立更加精细的培养环境。
目前研究者主要通过深入研究植物生理生化特性来强化对培养环境的控制，包括对植物生长所需要的特定物质的深入研究，还可以使用生物芯片和生物信息学等技术来优化培养环境。
2. 遗传工程技术的应用近年来，随着基因工程技术和植物细胞培养技术的深度结合，人们可以利用基因工程技术在植物细胞培养过程中进行基因转化，从而实现线粒体、叶绿体、质粒等的改造，使得基因形态能够实现更加准确、可控制的变化。
同时，由于基因工程技术的出现，使得对植物细胞增殖、生长、分化和诱导等过程的研究不再被时空限制，从而对植物细胞培养技术的突破和推广产生了积极的作用。
3. 利用高通量技术提高培养质量随着高通量技术的快速普及和成功应用，植物细胞培养技术也可以应用到更深层面的研究之中。
例如利用基因芯片技术，可以直接测定细胞的基因表达谱，在基因最终的表达谱中分别分析出在不同生长条件下植物的基因表达特征，从而利用大量的数据实现对植物细胞培养质量的高效控制，从而推进植物细胞培养技术的进一步发展。
三、植物细胞培养技术的应用随着植物细胞培养技术的逐步成熟和发展壮大，其应用领域也越来越广泛：1. 基因编辑利用植物细胞培养技术可以实现细胞和基因的批量编辑和调整，并在经过合适的培养条件下，通过生物技术手段来促进植物生长发育、产出更高产量的物质，或适应不适宜生长的环境。
植物细胞培养
植物细胞培养第七章植物细胞培养第⼀节植物细胞培养的理论基础⼀、植物细胞的全能性植物细胞全能性是指植物体的每⼀个活细胞具有发育成完整个体的潜在能⼒。
即植物体的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息，在适当的内、外条件下，⼀个细胞有可能形成⼀完整的新个体。
在植物的⽣长发育中，从⼀个受精卵可产⽣具有完整形态和结构机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。
同样，植物的体细胞，是从合⼦有丝分裂产⽣的，也应具有像合⼦⼀样的全能性。
但在完整植株上，某部分的体细胞只表现特定的形态和局部的功能，这是由于它们受到具体器官或组织所在环境的束缚，但细胞内固有的遗传信息并没有丧失。
因此，在植物组织培养中，被培养的细胞、组织或器官，由于离开了整体，再加上切伤的作⽤以及培养基中激素等的影响，就可能表现全能性，⽣长发育成完整植株。
⼆、植物细胞的脱分化和再分化通常，我们⽤于组织培养的植物材料，太多是已分化了的细胞。
⼀个已分化有⼀定机构和功能的细胞要表现它的全能性，⾸先要经过⼀个脱分化的过程。
脱分化：是指已分化的细胞在⼀定因素作⽤下，失去它原由的机构和功能，重新恢复分裂机能。
细胞脱分化的机构通常形成愈伤组织。
从外植体形成愈伤组织的过程，根据其群体细胞的形态、细胞分裂、⽣长活动和RNA相对含量的变动，⼤致可分起动期、分裂期和形成期三个时期。
起动期是细胞准备进⾏分裂时期。
外植体在外观上虽看不到多⼤变化，但代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进⾏，RNA 的含量急剧上升，细胞核和核仁增⼤。
分裂期的主要特征是被起动细胞进⾏活跃的细胞分裂。
这时细胞⽐起动的细胞更⼩，核和核仁更⼤，RNA含量继续上升，出现⾼峰。
由于细胞分裂活跃，细胞数⽬迅速增加，开始出现可见的愈伤组织球体。
紧接着进⼊形成期。
愈伤组织进⼀步发展，细胞分裂较多地出现在愈伤组织的周缘近表⾯部分，且分割⾯较多的是平周的，因此构成⼀个所谓愈伤形成层，相应的内部细胞显著增⼤，核和核仁变⼩，RNA含量急剧下降。
植物细胞培养技术
植物细胞培养技术植物细胞培养技术是一种以植物体中的组织和细胞作为外植体，在理想的环境条件下进行体外培养和繁殖的方法。
通过这种技术，可以实现植物的无性繁殖、基因转化以及药用植物次生代谢物质的生产等目标。
本文将重点介绍植物细胞培养技术的原理和应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理基于植物组织和细胞的可再分化能力。
在适宜的培养基和环境条件下，植物细胞可以分化为新的组织和器官，或者直接分化为整个植株。
培养基中的营养物质和激素是影响和调控细胞分化的关键因素。
通过合理调配培养基的成分，可以促使细胞分化为不同类型的组织和器官。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养一般分为以下几个步骤：1. 外植体的选择和预处理：外植体通常选择植物体中的组织部分，如茎尖、嫩叶等。
在培养前需要对外植体进行预处理，如消毒、切割等，以确保培养的无菌性和外植体的活力。
2. 培养基的配制：培养基的成分包括营养物质、植物激素和其他辅助物质。
根据培养的目标和所需组织类型的特点，可以针对性地调整培养基的配方。
3. 培养和分化：将外植体放置在培养基上进行培养，适时调整培养条件，如温度、光照等。
在培养过程中，外植体会发生细胞分化和组织构建。
4. 组织增殖和再生：在适当的生长阶段，可以通过分化培养基中的激素成分调节外植体的生长速度和特性，以促使细胞和组织的增殖和再生。
5. 植株移栽：当培养出足够数量和大小的植株时，可以将其移栽到土壤或其他适宜生长的介质中，实现其正常的生长和发育。
三、植物细胞培养的应用植物细胞培养技术在农业、林业、生物技术和药物生产等领域有着广泛的应用。
1. 繁殖与育种：植物细胞培养技术可以实现植物的大规模无性繁殖，从而加快植物的育种进程。
通过外植体培养和细胞分化，可以繁殖出与母体植株相同的新植株。
2. 基因转化：植物细胞培养技术可以实现外源基因在植物细胞中的转化和表达。
通过导入外源基因，可以改良植物的性状，提高农作物的产量和抗逆性，以及生产具有特殊功能的植物。
植物细胞培养
苯丙素类
O O
HO H
O
H
HO
CH3O
OCH3 OCH3
鬼臼毒素（抗肿瘤）
苯丙素类
OH
O OCH3
HO O CH2OH
OH OH O
水飞蓟素 ：治疗急、慢性肝炎、肝硬化、 中毒性肝损伤等）的良药。
紫草
HO O
HO
O
醌类
紫草素
CHCH2CH C HO
紫草根
CH3
天然色素，绛红色。抗 CH3 菌、抗炎、抗病毒、止
紫杉醇的发现
50年代末-60年代初：癌症病人大量增加
60年代中期：美国食品与药物管理局（FDA） 制定计划，广泛寻找、筛选治疗癌症的药物（ 动物、植物、微生物）
1969: 美国农业部（USDA）采样员在Oregon 洲采取到太平洋紫杉（pacific yew，短叶红豆 杉）树皮，后经筛选试验发现有强烈的抑制肿 瘤的作用
连续培养(continuous culture)：在一个容器 （或者系统）中连续不断的培养植物细 胞。
连续培养
成批培养
悬浮细胞培养的特点
1）细胞生长速度较快； 2）可以长期、连续、大规模培养细胞； 3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。
三、 细胞培养的应用
1. 进行细胞生物学研究：
通过适当的培养技术，人们可以连续观 察和记录（摄像）单个细胞的生长、分裂和 分化的全过程。因此，细胞培养技术是研究 细胞生长、分裂和分化的良好实验体系。
第五讲 植物细胞培养 Plant Cell Culture
第一节 植物细胞培养简介
一、概念：
在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖 或分化。
二、类型：
1、固体培养(solid culture)：在固体培养基中培养 细胞=静止培养。
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4.3 植物组织与器官培养
4.3.1 植物组织培养的定义： 在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
•
4.4.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象： 主要有：单细胞培养，单倍体培养（花药雄 性生殖细胞），原生质 根据培养系统： 主要有：固体培养和液体培养。
4.4.3 植物细胞培养的培养基
• 基础培养基有：
MS，B5，N6 。 主要有无机盐， 碳源， 有机氮源，有机酸等构成。 常用的培养基的组成：MS+植物生长激素+椰 子汁
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.4 植物细胞的培养：
• 4.4.1 植物细胞培养定义 • 定义：指在离体条件下，将愈伤组织或其它容易
分散的组织置于培养基中进行培养，得到分散成 游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从 而获得大量细胞群体的一门技术。目的是获得初 级和次级代谢产物。 可通过改变培养基成分及其浓度，生长调节剂的 选择等手段来实现代谢产物的诱导。
4.5.2 原生质体研究意义
研究组织和器官发育机制；
可以进行有关遗传操作；
研究植物细胞的生理功能；
诱导融合形成杂种细胞。
4.5.3 原生质体的制备 原材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化 原生质体活力检测
4.5.3.1 用于分离原生质体的材料来源
两个来源：
各种组织的叶 片，根尖等
愈伤组织
• 不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成 不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。
4.3.3 植物组织培养的基本步骤
• 培养材料的采集 • 培养材料的消毒 • 制备外植体 • 愈伤组织形成 • 根和芽的诱导 • 组培苗的练苗移栽
基本步骤
试管植物的两个核心步骤：一是愈伤组织的 形成，二是愈伤组织的分化
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.2 发展历史和研究意义：
4.2.1 发展历史：自学 4.2.2 研究意义： 具有重要的经济意义
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
愈伤组织的形成
愈伤组织的分化
1） 培养材料的采集：
• 可以取受精卵，发育中的分生组织（根尖，
茎尖），雌雄配子等。 • 最常用的培养材料是茎尖，通常切块 0.5cm以下，如果是培养无病 毒苗，其长度在0.1mm以下。
外植体（培养材料）选择的原则
• 必须含有活细胞。 • 幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。 • 母株必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。 • 母株必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
4.3.7 人工种子
在一定条件下，愈伤组织细胞诱导分化出具 有胚芽，胚根和胚轴的胚状结构—胚状体
定义: 即最外面包裹一层有机薄膜的植物胚 状体 优势： 便于运输和储藏；提高生产效率； 保存珍贵品种
人工种子
外层：固定化膜（有机薄膜），保护胚状体水分， 防止外部力量冲击 中间：营养成分和植物激素 内层：包裹的胚状体或芽
看护培养特点：
优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。 缺点： （1）不能在显微镜下直接 观察细胞的生长过程。
II 饲养层培养：
• 饲养层培养是用处理
过的（X射线处理） 无活性的或分裂很慢， 不具备分裂能力的细 胞来饲养所养的靶细 胞(要培养的细胞）。
红色的细胞为饲养层细胞； 蓝色的为靶细胞
总的原则：健康无病的年幼组织。
2）培养材料的消毒
材料 自来水和蒸 馏水冲洗 酒精中浸泡 30-60秒
无菌水 冲洗3遍
0.01%升汞 （HgCl2)消毒10 分钟
3） 制备外植体
在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片， 剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。
4）接种和培养（愈伤组织的形成， 生长和分化） • 接种：无菌环境下，外植体接种在培养基
3）双层滤纸培养 在饲养层和靶细胞层之间放两张滤纸,上面 一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继 续培养.
4）微室培养
定义: 将单细胞培养在少量的培养基中培养。
优点： （1）在培养过程中，可 以连续进行显微观察一个细 胞的生长、分裂和形成细胞 团的全部过程.
缺点： （1）培养时间较短. （2） 操作麻烦。
• 愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强 。
外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状， 疏松易碎。
诱导愈伤组织形成的条件：
• 植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极
为重要的因素： 包括生长素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂 素（KT，6-BA，ZT）：生长素使用浓度一 般在0.01-10mg/L， 分裂素使用浓度一般 在0.1-10mg/L 其他一些条件：植物生长力、来源、培养基 的种类、培养条件等。
6）组培苗的练苗移栽
• 试管苗进入自然环境前必须进行练苗。 • 将培养容器打开，自然光照3天，取出小
苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好 的基质中。
4.3.4 愈伤组织的形成过程
在接种和培养的过程中涉及到愈伤组织的 形成，生长和分化。愈伤组织形成一般要经 过三个步骤：
1）启动期：指成熟细胞或原生质准备分裂和脱 分化的时期，需要合适的诱导剂：NAA，IAA 等。 2）分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化， 外层细胞，不断分裂、增生子细胞的过程 。 3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞 内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而 使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分 化出形态和功能不同的细胞，分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等 。
pH值（5.8） 琼脂
• 封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封
口，培养皿用无菌胶带封口 • 温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%） • 增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分 株或切段转入增殖培养基中继代培养。
5）愈伤组织的生成
• 成熟细胞经脱分化等一系列过程，产生一
团不定型的疏散排列的薄壁细胞---愈伤组 织。 • 植物愈伤组织的芽和根的分化由生长素和 细胞分裂素的浓度及比例决定的。当生长 素浓度大于细胞分裂素浓度时愈伤组织 分化根，反之则形成芽。
炼苗移植
炼苗
4.3.5 植物器官培养
• 定义：指将植株上的各种器官从母体上分离出
来，放在无菌的人工环境让其进一步发育，最终 长成幼苗的过程。 植物器官主要包括：毛状根，芽，体细胞胚等 植物器官培养技术与植物组织培养技术基本一致。
4.3.6 植物组织培养的应用：
• 1.无性繁殖系快速繁殖 • 2.获得无病毒植株 • 3.新品种育种 • 4.在遗传、生理、生化和病理研究上的应用 • 5.种质资源保存与创新 • 6.产业化生产：花卉，果蔬脱毒
4.4.4.2 单细胞培养
• 平板培养 • 看护培养 • 微室培养 • 双层滤纸培养 • 悬浮培养
适宜于得到的细胞 数目少，细胞比较 珍贵的情况下使用
1) 细胞平板培养
• 平板培养（plating culture)是指将一定密
度的悬浮细胞接种到或混合到一薄层固体培 养基中培养的技术,类似于微生物细胞的平板 培养。
定义 :指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 基本技术: （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固 体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块活跃生长 的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组 织块上放一片已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤 纸上。 （4）恒温培养1-3月。
4.5.3.2 酶消化
取材消毒
取植物组织，消毒后去掉表皮，剪碎；
• 有丝分裂抑制法: 在指数生长期的细胞悬浮
培养物加入一定浓度的有丝分裂抑制剂如 秋水仙素4-6小时，作用不可逆的。
4.4.4.4 植物细胞的保存
• 继代培养保存法 • 低温保存法：5-10度 • 冰冻保存法：-20度或液氮中
4.5 原生质体培养
• 原生质体的相关的概念和研究意义 • 原生质体的分离
• •
•
基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞， 进而发育为一个完全相同的生物体。 外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。 愈伤组织：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分 化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄 壁细胞（具有未分化细胞的特性）。 胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚 根和胚轴的胚状结构。
上，每瓶接种4-10个。
培养基的主要成分： 水 无机成分： 无机大量元素 氮：铵盐、硝酸盐混合
磷：磷酸盐 钾：钾盐 钙、硫、镁
无机微量元素
主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯
有机成分（碳源）：
糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。
植物生长调节物质：
生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT
5) 悬浮培养
• 将一定密度的悬浮细胞接种于液体培养基
中,在保持良好的分散状态下培养. 适宜于消 化得到的细胞数充足的情况下使用。
悬浮培养
4.4.4.3 细胞的同步化
• 细胞同步化：指同一培养体系的所有细胞都同时
通过细胞周期的某一特定时期。
• 有饥饿法，抑制法和冷处理法等。
可以通过饥饿法获得G1或G2期同步化细胞。
第四章 植物组织与细胞培养