动物细胞体外培养知识

三级细胞库包括：原始细胞库、主细胞库（MCB）、工作 细胞库（WCB）。 二级细胞库包括：主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）。 原始细胞库：由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞 群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体。供建立主 细胞库用。
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主细胞库：取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、 增殖后均匀混合成一批，定量分装，供建立工作细胞库用。 工作细胞库：由MCB细胞传代扩增达到一定传代水平的细 胞，合并后制成一批均质的细胞悬液，定量分装。 细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和 内源因子的检测、致瘤性检测等。
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（5）灌流式培养：是把细胞和培养基一起加入反 应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地 将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注 新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于 取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在 反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取 出了部分细胞。
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七、细胞库
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5、大规模细胞培养方式简介：
（1）分批式培养：该方式采用机械搅拌式生物反 应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应 器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添 加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当 的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作 方式。
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（2）流加式培养：是在批式培养的基础上，采用 机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以 悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养 基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中 根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓 缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较 高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养 过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或 衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞 和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
1、无菌操作间的清洁 2、超净工作台的清洁 3、培养器皿的准备：洗刷 包扎、灭菌 4、培养基的配制、除菌过滤及无菌验证
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六、细胞培养的基本操作
1、细胞冻存操作 冻存细胞：1*107cells/ml*1ml/管 冻存液配制：（培养基：血清：DMSO=7：2：1） 冻存程序：4℃、30~60min -70 ℃、过夜 -20 ℃、1~2h
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四、设施设备及培养器皿
1、设施设备：无菌操作间、超净工作台、CO2培养箱、灭 菌柜、离心机、显微镜、细胞计数板、冰箱、工作台、生 物反应器、电脑等。 2、培养器皿：培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶、移液管、离 心管等。 3、其它常用物品：酒精灯、镊子、止血钳、纱布、脱脂 棉、胶塞等。
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五、细胞传代的准备工作
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（3）半连续式培养：又称为重复分批式培养或换 液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮 培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间 隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培 养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
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（4）连续式培养：是一种常见的悬浮培养模式， 采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细 胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期 的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向 生物反应器连续添加新鲜培养基，同时，含有细 胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以 保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限 延续下去。
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二、基本条件
1、无菌无毒的培养环境。 2、恒定适宜的培养温度。 3、合适的气体环境和pH。 4、充足的营养，包括多种氨基酸、维生素、辅酶、 核酸、嘌呤、嘧啶、生长因子。
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细胞培养基介绍
天然培养基---血清 无血清培养基---人工合成化合物，成分确定的培养基， 例如CHO325。 无蛋白培养基---不添加蛋白， 但可能包含动物或植物来源的成分。 化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
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一、基本概念
1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此 时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为 目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬 浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生 物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
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八、需要解决问题及实验方法
1、为了提高细胞密度、活度，根据细胞生长特性，摸索 细胞培养方式。包括接种密度、接种体积、稀释比例、补 料速度、培养温度、维持温度、溶氧、搅拌速度、pH等参 数。 2、为了提高表达量，摸索适合细胞增殖和表达的培养基， 以及葡萄糖、氨基酸等营养物质的添加速率。 3、实验方法：摸索查询细胞生长特性，设计实验方案， 进行各种因素交互实验，利用各种设计方法和统计方法对 比分析最佳的因素水平和参数比例。优化选择出适合的培 养方法和培养基。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移 到-70度，18h后，在液氮中保持。
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2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解。 （3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合 适的离心强度。 （4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新 鲜培养基重悬后置于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。
动物细胞体外培养基础知识
2009-09-25 石欣欣
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基础知识要点
一、动物细胞培养的基本概念 二、细胞培养的基本条件 三、细胞培养的基本过程 四、细胞培养的设施设备及培养器皿 五、细胞传代的准备工作 六、细胞培养的基本操作 七、细胞库 八、大规模细胞培养提高表达量需要解决的问题 及实验方法 九、细胞培养需要注意的问题
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三、基本过程
1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则 2、从细胞生长过程来说包括： （1）延迟期（潜伏期）---传代初期，细胞增殖缓慢。 （2）指数生长期（对数生长期）---细胞快速繁殖期。 （3）停滞期（平台期）---细胞数量不变， 但仍进行代谢活动，进行分泌表达。 （4）衰亡期（凋亡期）---细胞自溶、死亡。
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3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品 放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸， 根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新 鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密 切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此 熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
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4、生物反应器培养细胞的基本操作流程 （1）反应罐安装、调试电极、管路连接。 （2）反应罐洗刷、灭菌。 （3）检查灭菌管路、连接电极线。 （4）通过取样口抽出罐内灭菌水。 （5）将补料、收料容器连接到反应罐上，接种细胞到罐内。 （6）设定T、DO、STIRR、pH，调节通气管路。 （7）根据实验设计，进行取样，监控密度、活度、葡萄糖等指 标，记录参数变化，适时进行补料、收料无菌操作。
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九、需要注意的问题
1、意识：无菌操作意识，细心、耐性。 2、原则：抓准细胞生长特性，稳定传代。 3、思路：及时记录原始数据，对比统计分析实验结果， 为下一步实验计划做准备。 4、基本保障：工作室每日清洁，培养箱每周清洁，无菌 培养基和实验物品的及时供应，实验人员思路清晰、无菌 意识要强。
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谢 谢
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