生物化学第二章 蛋白质.

同样对于三个可解离的氨基酸例如天冬氨酸和赖氨酸
来说，只要写出它的解离公式，然后取两性离子两边 的pK值的平均值，则得其 等电点。如天冬氨酸的解离 如下：
R+
pK1’ R0 pK2’
R- pK3’
R2-
则 pI= 1/2（pK1’+pK2’） 而赖氨酸的解离如下：
R2+ pK1’ R+ pK2’ R0 pK3’ R-

[质子受体]

pH=pK’+lg---------------

[质子供体]
pK’为表观解离常数的负对数，可用
测定滴定曲线的实验方法求得。其拐点处 PH值即为PK’
等电点的计算公式:
对于一氨基一羧基和一氨基二羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK1+Pk2)/2
对于二氨基一羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK2+pK3)/2
2.2.1.4 氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB) 的反应（sanger反应）
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene） 弱碱中
氨基酸
作用：多肽及蛋白质的
N-末端氨基酸上面的游 离氨基也能与2,4-二硝 基氟苯作用.所以此反应 常用于蛋白质一级结构
氨基末端的测定.
DNP-AA(黄色)
CH2 CH2 Cl S: R1
Cl CH2 CH2 S+ R1
R2 H2N CH COO-
R1SCH2NHCH(R2)COO-
用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。
2.2.1.7 形成西佛碱反应：氨基酸的α-氨基能与醛类化合物
反应生成弱碱，即所谓西佛碱（Schiff’s base）。
R’ | C=O + | H 醛
R
R’ R
|
-H2O
ห้องสมุดไป่ตู้||
H2N-C-COOH------------→ C=N-C-COOH
|
||
H
HH
氨基酸
西佛碱
西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的 中间物。
2.2.1.8 与荧光胺反应：荧光胺可与α-氨基酸中的氨基反应
生成产荧光的化合物，且反应非常灵敏。它具有特定的激发波长
（390纳米）和发射波长（475纳米），读取发射光的荧光强度 即可测定氨基酸的含量。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
-OOC CHCH2 SH NH3+
-OOC CHCH2 SH NH3+
-OOC CH CH2 NH3+ S
-OOC
S
CH CH2 NH3+
胱氨酸
作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或
端裂。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子 两边的pK值和的一半。
2.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负 电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等 电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电 场中向阴极移动。
3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈 远，AA带净电荷愈多。
举例
例1: 甘氨酸的pK1=2.34,pK2=9.60.问该氨基 酸在pH为5.0时在电场中的移动方向.
怎么办
解:先求出甘氨酸的等电点,再根据等电点与pH的关系,判断其 所带电荷,从而可得到答案.
GlypI=(pK1+Pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97 因为等电点(5.97)大于pH(5.0),故而带正电荷,所以在电场 中向负极移动.
例2:LyspK1=2.18,pK2=8.59, pK3=10.53,问在pH为4.0和在 11.5时各带何种电荷,并说明在电场 中的移动方向.
COOH3+NCHCH2S-+ S
CO2H NO2
S NO2
COO-CO2H H+3NCHCH2S-S-
硝基苯甲酸二硫化合物(DTNB)
NO2 + HSCO2H
COONO2
作用：可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(2) 羟基的性质
O
-OOCCHCH2OH + NH3+
R0
K2’
R- + H+
K2’=[R-][H+]/R0 则 [R-]= [R0] K2’/ [H+]
当在等电点时，[ R+] = [R-] 则有：
[H+]2 = K1’ ·K2’ 即 [H+]= （K1’ ·K2’）1/2
等式两边取负对数得： pH=1/2（pK1’+pK2’） 也就是pI= 1/2（pK1’+pK2’）
O
NH3+
ICH2CNH2
-OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
作用：这些反应可用于巯基的保护。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
-OOC CHCH2 SH + HO-Hg+ NH3+
COO-
-OOC CHCH2 S Hg+ NH3+
COO-
作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒。
等电点的主要用途: 1.分离氨基酸(离子交换,电泳等). 2.氨基酸制备(等电点沉淀法,电泳等).
等电点计算公式的推导：在氨基酸完全质子化时，各 种不同氨基酸的等电点可由下面的方法推导出来：
对于中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸）：以R 表示带电情况，则：
R+
K1’
R0 + H+
K1’=[R0][H+]/[R+ ] 则 [ R+] = [R0][H+]/ K1’
F POCH(CH3)2 OCH(CH3)2
二异丙基氟磷酸酯
-OOCCHCH2O NH3+
作用：可用于修饰蛋白质。
O POCH(CH3)2 OCH(CH3)2
2.2.4 侧链基团的化学性质
(3)咪唑基的性质
组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生
理条件下具有缓冲作用。 组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。
怎么办
解.因Lys属于碱性氨基酸,所以,它的等电点为:
pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56
当pH为4.0时,pI大于pH,故是在酸性条件下,氨基酸本身带正 电,在电场中向阴极移动.
当pH为11.5时,pI小于pH,故是在碱性条件下,氨基酸本身带负 电,在电场中向阳极移动.
第二章 蛋白质
3.1 氨基酸的两性解离性质及等电点 3.2 氨基酸的化学性质 3.3 蛋白质的分子结构 3.4 蛋白质测序的基本方法路线
2.1 氨基酸的两性解离性质及等电点
氨基酸分子既含有酸性的羧基(-COOH)， 又含有碱性的氨基(-NH2)。其-COOH能放 出质子(H＋)，而变成-COO－；其-NH2 能 接受质子，而变成-NH3+。因此，氨基酸 是两性电解质(ampholyte)。
+ HF
2.2.1.5 氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate）
弱碱中 (400 C)
(硝基甲烷 400 C) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
2.2.1.6 烃基化反应
2.2.1.9 脱氨基反应：见氨基酸代谢。
（ 1
2.2.2 -羧基参与的反应
）
成
盐
氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸
反 的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于
应 水。
应（ 2 ） 形 成 酯 的 反
2.2.2 -羧基参与的反应
NH3+ R CH COO- + R2OH
NH2.HCl R CHCOOR2 + H2O
2.2.1.3 与酰化试剂反应： 氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用
时，氨基即被酰基化。例如与苄氧（苯甲氧）甲酰氯 （carbobenzyloxychlorride）反应：
这里-NH2中的一个H被苄氧甲酰基（可简写为Cbz）取 代生成Cbz-氨基酸。除了苄氧甲酰氯外，酰化试剂还 有叔丁氧甲酰氯，对-甲苯磺酰氯以及邻苯二甲酸酐等。 这些酰化试剂在多肽的蛋白质的人工合成中被用作氨 基的保护试剂。
（
2.2.2 -羧基参与的反应
5
） 脱
NH3+
羧 R CHCOO-
R CH2 NH2 + H+ + CO2
反
应
用途：酶催化的反应。
2.2.3 -氨基和羧基共同参与的反应
()
O
茚三酮
C
H2O
CO
C
H2O
1
O O
与 茚
C OH
C C
OH +
H2N
O
CHCOOH R
三
O
O
酮
C
HO C
反
C C
O + 2NH3 + H
氨基酸的两性解离符合Bronsted – Lowry的酸碱质 子理论，即氨基酸在水溶液中的偶极离子既起酸 （质子供体），又起碱（质子受体）的作用。氨基 酸完全质子化时，可以看成是多元酸.侧链不解离的 中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基 酸可视为三元酸。
在这里同样可以利用Handerson – Hasselbalch公式进行pH或氨基酸各种离 子浓度比例的计算：
另一个酰化试剂是丹磺酰氯（dansyl chloride）， 它是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯的简称，被用于多肽链 NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
与丹磺酰氯反应
AA
DNS + 多肽
蛋白
弱碱
AA DNS- 多肽
酸
蛋白
DNS-AA +游离AA
（乙醚抽提，有荧光）
用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.
可以与ATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸， 从而使酶活化。
组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成 烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失
则
pI= 1/2（pK2’+pK3’）
举例 将含有Asp，Gly，Thr，Leu和Lys的pH＝3.0的缓冲 溶液，加到预先用同样缓冲溶液平衡过的Dowex－50 阳离子交换树脂中，然后用该缓冲溶液洗脱，这5中 氨基酸洗脱顺序如何？并说明原因。
Asp >Thr> Gly> Leu>Lys
怎么办
小结
+
◆ 通过改变溶液的pH，可使氨基酸分子的解离状态发生改变。
◆ 氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境 中，主要以阴离子的形式存在。
R
CH NH3+ COOH
+ OH-
+ H+ (pK´1)
R
CH NH3+ COO
+ OH+ H+ (pK´2)
R
CH NH2 COO
pH< pI
净电荷为正
不能直接用酸或碱来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱 滴定的等电点pH过高（12-14）或过底（1-2），没有适当的指 示剂可被选用。但如果加入过量的甲醛，生成二羟甲基氨基酸 后即可降低氨基的碱性，而增加羧基的酸性，使其PK’值减少23个pH单位。这时即可用标准的NaOH溶液滴定。
作用: 氨基酸的甲醛滴定（formol titration）法是氨基酸测定的一 种常用方法。当氨基酸溶液存在1摩尔/升甲醛时，滴定终点由 pH12左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域，这就是 SØ rensen甲醛滴定法的基础。
用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。
（ 3
2.2.2 -羧基参与的反应
）
形
成 酰
NHPG PCl3, PCl5 or SOCl2
NHPG
卤 R CHCOO-
R CHCOCl
的
反
应 用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。
2.2.2 -羧基参与的反应
（ 4 ） 叠 氮 化 用途：常作为多肽合成活性中间体。 反 应
C C
应
O
O
O
C OH C
水合茚三酮
C OH
O
O
C C
H
+ RCHO + NH2 + CO2
C OH
O O-NH4+O
C
C
CN C
+ 2H2O
C
C
OO
用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。
（ 2.2.3 -氨基和羧基共同参与的反应
2
） 成 肽 反
H2N
R1 O C C OH
+
HN
R2 C
COOH
- H2O
H2N
R1 O CC
R2 N C COOH
H
HH
H HH
应
肽键
用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
-OOC CHCH2 SH NH3+
O
CH2OCCl -OOC CHCH2 SOCCH2
CH2Cl
NH3+
O
-OOC CHCH2 SCH2
例3：计算0.1mol/L的谷氨酸溶液 在等电点时主要的离子浓度？
怎么办
2.2 氨基酸的化学性质
2.2.1 有氨基参与的反应
2.2.1.1 与亚硝酸的反应
R-CH| -COOH+HO-ON→N2+H2O+R-C|HCOOH
NH2
OH
此性质为Van Slyke氨基氮测定方法的原理.
2.2.1.2 与甲醛的反应：氨基酸是一种两性电解质，但
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等 ，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为 该氨基酸的等电点(isoelctric point)。
两个概念
两性离子:同一分子上带有正 负两种离子
等电点:净电荷为零时的pH 值(用pI表示) ◆ 等电点是氨基酸的特征常数