蛋白浓度测定

蛋白浓度测定

BCA法测定样品蛋白的浓度

1、原理：在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。通过制备经过梯度稀释的、浓度抑制的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质仪器检测，根据绘制出的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

2、准备：96孔板、枪（枪头）、酶标仪（提前开启）、Pierce的BCA蛋白定量分析试剂盒、PBS、蛋白标准品（-20℃分装保存）、PBS缓冲液、待测蛋白样品。注意：蛋白标准品有两种：一种是BCA试剂盒原装蛋白标准品（2mg/ml），另一种是10mg/ml蛋白标准品，需要稀释到2mg/ml。

3、操作步骤：

①准备1ml RIPA裂解液：加100µl phosstop、10µl cocktail和10µl PMSF到880µl 1X RIPA buffer中，混匀后置于4℃中备用。（若蛋白提取完后直接进行蛋白定量，则可直接用剩余的裂解液。）

②准备BSA标准品：Pierce BSA原浓度为2 mg/ml，取5个200µl EP管按下表配好标准品。

设置好每孔所加样品后（如下表）：

③涡旋混匀标准品，每个加10ul （横排并列第二个做复孔）。

④涡旋混匀待测蛋白，每个加1ul （横排并列第二个做复孔）。

⑤加140ul水到标准品孔，149ul水到待测样品孔。

⑥根据数量（标品5*2个+待测样品n*2个），按A:B=50:1配制BCA工作液，每孔100ul。（若需5ml，则5ml A液+ 100ul B液）

⑦用保鲜膜覆盖孔板后，再盖上孔板盖子，置于60℃孵育20min，在酶标仪540-570 nm (562 nm) 处读值。

4、注意事项：

①在加标准蛋白或样品蛋白时，应用相应量程的枪头对溶液进行充分的混匀，以降低因溶液浓度不均对实验造成的影响。

②在操作过程中，对枪的量取要细心，防止枪头内残余太多标准蛋白样品，影响标准曲线的绘制。

③此法测浓度，所加的标准品及样品的量都极少，在操作过程中，在吸取标准蛋白及样品时，尽量只让枪头的口接触液面吸取，以减少实验误差。

④使用排枪加液体时要注意观察排枪所吸取液体的体积是否一致，加入孔中时避免打出气泡，干扰酶标仪测定。

⑤测浓度要求精确，否则会导致上样量不一致，所以每个样品都要换枪头。