实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素

实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素

一、实验目的

了解ELISA的基本原理，及其优缺点；掌握间接ELISA法的试验操作过程。

二、实验原理

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。

三、实验器材

1、ELISA试剂盒

其组成如下：

1.1 包被抗体的反应板48孔

1.2 A试剂：样品稀释液l瓶

1.3 B试剂：AFB1标准溶液l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)

1.4 C试剂：酶标抗原l瓶

1.5 D试剂：酶标抗原稀释液l瓶

1.6 E试剂：浓缩洗涤液l瓶

1.7 F试剂：显色底物液a l瓶

1.8 G试剂：显色底物液b l瓶

1.9 H试剂：终止液l瓶

1.10 反应板框架l块

2、仪器

1.1酶标仪(内置450nm滤光片)

1.250µL微量移液器及配套吸头

1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)

1.4冰箱(4℃-8℃)

1.5 感量0.0lg的天平

1.6调速振荡器或超声波清洗器

1.7 离心机5000r/min

1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等

1.8 小型粉碎机或碾钵

1.9其它：滤纸，吸水纸等

四、实验步骤

1、实验准备

1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”

1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)

称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100µL样品提取液+100µL样品稀释液，总稀释10倍），即为待测样液。1.1.2 花生

样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡l0min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如100µL样品提取液+300µL 样品稀释液，总稀释20倍），即为待测样液。

1.1.3 一般饲料及原料

称取5.0g样品于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去1/4初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100µL 样品提取液+900µL样品稀释液，总稀释50倍），即为待测样液。

1.2 试剂的配制

1.2.1每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。

1.2.2 取适量E 试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释20倍待用。例如：取3mL E 试剂(浓缩洗涤液)，加57mL 超纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够24孔使用。 2、操作步骤

2.1 试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min 以上，平衡至室温。

2.2 小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定l 号孔为仪器调零孔，2-7号孔为AFB 1标准对照孔，其余孔为样品孔。

2.3 洗涤：每孔加入250µL 左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。

2.4 反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配制好的溶液及待测样液。 第一步：l 号孔加入50µL A 试剂(样品稀释液)，2-7号孔分别加入系列的B 试剂(AFB 1标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL ) 50µL ，其余孔加入相应的待测样液。 第二步：l 号孔加入50µL D 试剂(酶标抗原稀释液)，其余各孔均加入50µL C 试剂（酶标抗原溶液）。

第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混合均匀。

表1 反应物组成

操作次序

加入量 孔 号 1

2

3

4

5

6 7

8

9

10

11

12

1 50 µL A 0 0.1 0.25 0.5 1

2 ……待测样液……

2

50 µL

D

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

3

混 匀

2.5 反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min 。

2.6 洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250µL 左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。

2.7 显色：每孔分别加入F 试剂(显色底物液a)和G 试剂(显色底物液b)各50µL ，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min 。

2.8 终止与仪器测定：每孔分别加入H 试剂（终止液)50µL ，摇匀后用酶标测定仪在450nm 波长处测定各孔的吸光度A 值。 3、试样测定与结果计算

将系列AFB 1标准溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL)测得的吸光度A 值，绘制成标准曲线(见示意图)。横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)，纵坐标为各标准液孔A 值与0ng/mL 标准液孔的A 值的比值(A （标准液）／A （0ng/mL ））（若同时有平行实验数据，