高产胞外多糖的乳酸菌菌种的筛选
产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究的开题报告
高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究的开题报告题目：高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究研究背景：胞外多糖是一种重要的生物高分子，具有广泛的生物活性和药理学应用价值，例如抗肿瘤、增强人体免疫力和抗菌等。
乳酸菌是一类重要的益生菌，常被用作发酵食品中的菌种。
研究胞外多糖乳酸菌的培养和优化方法，有助于提高其胞外多糖的产量和生产效率。
研究内容：本研究旨在筛选高产胞外多糖的乳酸菌菌株，优化其培养基的组成，以提高胞外多糖的产量。
具体研究内容如下：1. 通过筛选和鉴定，选择出能够高效合成胞外多糖的乳酸菌菌株。
2. 优化胞外多糖乳酸菌的培养基，包括选定最优的碳源、氮源和微量元素等。
3. 研究培养条件对胞外多糖产量的影响，如pH值、温度和培养时间等。
4. 对优化后的培养基进行验证以确定其优化效果，包括胞外多糖的产量、质量特性和生物活性等。
预期研究成果：通过本研究，预期能够筛选出高产胞外多糖的乳酸菌菌株，并优化其培养基，从而提高胞外多糖的产量和生产效率。
同时，本研究还将对胞外多糖的质量特性和生物活性进行分析和评估，为其在药物和食品行业中的应用提供基础研究数据。
研究方法和技术路线：1. 乳酸菌菌株筛选和鉴定：从发酵食品或其他环境样品中筛选出乳酸菌，并进行基本鉴定。
2. 胞外多糖提取和分析：采用合适的胞外多糖提取方法，并采用高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（NMR）等手段对提取的胞外多糖样品进行分析和鉴定。
3. 培养基优化和胞外多糖产量测定：通过选用不同的碳源、氮源和微量元素等优化培养基的组成，同时调控培养条件，以提高胞外多糖的产量。
测量胞外多糖的产量并进行统计学分析。
4. 胞外多糖的质量特性和生物活性评估：对优化后的胞外多糖样品进行质量特性分析和生物活性评估，包括分子量、甲基化程度、抗氧化活性和抗菌活性等。
研究意义和应用价值：本研究将提高胞外多糖乳酸菌的产量和生产效率，并研究其质量特性和生物活性等，为其在药物和食品行业中的应用提供基础研究数据。
高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化
高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养条件优化孙军德;刘先【摘要】从酸菜汁和生鲜奶中筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌L3,应用苯酚一硫酸法测定其胞外多糖的产量.分别改变基础培养基的碳源、氮源、发酵温度、时间、pH等条件,探索其对乳酸菌L3胞外多糖生物合成能力的影响.结果表明:葡萄糖和蛋白胨分别是乳酸菌产生多糖的良好碳源和氮源.该菌株胞外多糖的最佳生物合成条件为:初始pH值6.5,发酵温度37℃,发酵时间24h,此条件下胞外多糖的生物合成量为108.49mg·L-1.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2010(041)001【总页数】4页(P90-93)【关键词】乳酸菌;胞外多糖;筛选;培养条件优化【作者】孙军德;刘先【作者单位】沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110866;沈阳农业大学,土地与环境学院,沈阳,110866【正文语种】中文【中图分类】Q939.11.7乳酸菌是能从葡萄糖（或可利用的碳水化合物）发酵产生大量乳酸的一群细菌。
它们无处不在，广泛分布在人体、动物、植物和整个自然界。
乳酸菌用途广泛，在食品中的应用有着悠久的历史，很多乳酸菌菌株被认为是没有致病可能的。
因为其的安全性，乳酸菌广泛应用于食品和药品领域。
作为保健食品和药品，可以改善和提高人的健康水平，延年益寿；还可以作为微生物学和微生态学领域研究的模式生物。
大量的乳酸菌被人们给予“安全”或“通常是安全的”（GRAS）的地位[1-3]。
多糖是指由20个以上单糖组成的糖类化合物，根据来源不同分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。
根据糖类组成不同，又可分为同多糖和杂多糖。
乳酸菌胞外多糖（lactic acid bacterium expolysaccharides，LAB EPS）是由乳酸菌在生长代谢过程中发酵产生并分泌到细胞外的黏液或荚膜多糖，是常渗入培养基中的一种糖类化合物[4-5]。
乳酸菌EPS可以改善发酵乳的组织状态和菌株对肠道黏膜的吸附。
水牛乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定
水牛乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定唐艳;谢芳;杨承剑;农皓如;冯玲;曾庆坤【摘要】从生水牛乳中筛选出两株高产胞外多糖(EPS)的乳酸菌株LB2、LB7,经MRS肉汤培养基发酵后,菌液中的胞外多糖(EPS)产量分别达135 mg/L、148mg/L,通过形态学、生理生化特征、API细菌鉴定系统、16S rRNA序列分析,鉴定出菌株LB2为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),LB7为类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides).将其应用到水牛乳酸奶的发酵中,结果表明,植物乳杆菌LB2和类肠膜魏斯氏菌LB7均可用来发酵水牛乳酸奶,且能有效增加酸奶的黏度和胞外多糖产量,其黏度和EPS产量分别为4 050mPa·s和149mg/L.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】4页(P70-73)【关键词】乳酸菌;胞外多糖;筛选;菌种鉴定【作者】唐艳;谢芳;杨承剑;农皓如;冯玲;曾庆坤【作者单位】中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】Q939乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的黏液多糖或荚膜多糖，属于微生物胞外多糖的一种［1］。
酸奶是以鲜奶或乳制品为原料，经均质（或不均质）、杀菌、冷却后加入特定微生物发酵剂、保温发酵而制成的产品。
酸乳在生产过程中乳酸菌会产生一种多糖类物质，即乳酸菌胞外多糖［2］。
乳酸菌胞外多糖可赋予酸乳特殊的质构和风味，如增加酸乳的黏性和流变性、提高酸乳的持水性防止乳清析出、增强凝乳强度、增加酸乳的口感等［3］。
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》范文
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌是一类重要的微生物，其产生的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）具有多种生物活性，包括增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等作用。
因此，对乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究具有重要的科学意义和应用价值。
本文旨在探讨乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化方法及其免疫活性的研究进展。
二、乳酸菌胞外多糖的筛选1. 菌种筛选首先，从各种乳酸菌中筛选出能够产生胞外多糖的菌种。
通过观察菌株在培养基上的生长情况、产糖量的多少以及产糖速度的快慢等因素，初步筛选出具有产糖潜力的菌种。
2. 发酵条件优化对初步筛选出的菌种进行发酵条件的优化，包括温度、pH值、接种量、培养时间等因素的调整，以提高胞外多糖的产量和质量。
三、乳酸菌胞外多糖的纯化1. 初步纯化采用离心、沉淀、超滤等方法对发酵液中的胞外多糖进行初步纯化，去除杂质和未完全分解的物质。
2. 高级纯化通过凝胶过滤、离子交换、高效液相色谱等方法对初步纯化后的胞外多糖进行进一步纯化，得到较为纯净的胞外多糖样品。
四、免疫活性研究1. 细胞免疫实验通过细胞免疫实验，观察乳酸菌胞外多糖对免疫细胞的影响，包括刺激淋巴细胞增殖、促进细胞因子分泌等作用。
2. 动物实验通过动物实验，观察乳酸菌胞外多糖对动物免疫功能的影响，包括增强体液免疫、细胞免疫等作用，以及其对肿瘤的抑制作用等。
五、结果与讨论经过筛选、纯化后的乳酸菌胞外多糖具有较高的纯度和生物活性。
在细胞免疫实验和动物实验中，均表现出较强的免疫增强作用，能够刺激免疫细胞增殖、促进细胞因子分泌，增强体液免疫和细胞免疫等作用。
此外，乳酸菌胞外多糖还具有抗肿瘤、抗氧化等作用，具有广泛的应用前景。
在研究过程中，我们还发现乳酸菌胞外多糖的产量和纯度受发酵条件、菌种类型等多种因素的影响。
因此，在今后的研究中，需要进一步探讨不同因素对乳酸菌胞外多糖产量和纯度的影响，以及不同来源的乳酸菌胞外多糖的生物活性差异等方面的内容。
高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化
第３４卷第３期２０２０年５月兰州文理学院学报(自然科学版)J o u r n a l o fL a n z h o uU n i v e r s i t y ofA r t s a n dS c i e n c e (N a t u r a l S c i e n c e s )V o l ．３４N o ．３M a y ２０２０收稿日期:２０２０Ｇ０３Ｇ１９基金项目:宿州学院科研平台开放课题(２０１９yk f ２９)作者简介:孔德卉(１９９３Ｇ),女,安徽宿州人,助理实验师,研究方向:食品生物技术．E Ｇm a i l :s z x y y pl ＠１６３．c o m．㊀㊀文章编号:２０９５Ｇ６９９１(２０２０)０３Ｇ００５３Ｇ０７高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化孔德卉,蒋家璇(宿州学院生物与食品工程学院,安徽宿州２３４０００)摘要:以本实验室保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定它们的产胞外多糖的能力,得到植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖能力最强,产量为１０１２．６μg /m L ,以此菌为供试菌,采用响应面法优化其产胞外多糖的条件．通过单因素试验,考察菌种接种量㊁培养温度㊁不同碳源及浓度对胞外多糖产量的影响,在此基础上,采用响应面法进一步优化该菌产胞外多糖的条件．结果表明,影响植物乳杆菌２Ｇ２的胞外多糖产量的因素主次顺序为乳糖浓度＞菌种接种量＞培养温度,最佳优化条件为乳糖４５g /L ㊁接种量为３．５％㊁培养温度为３９ħ,在此条件下胞外多糖的产量为１４９８．９１μg /m L ,是优化前的１．４８倍．关键词:乳酸菌;胞外多糖;响应面法中图分类号:T S ２０１．３㊀㊀㊀文献标志码:A0㊀引言乳酸菌(l a c t i ca c i db a c t e r i a ,L A B )作为一种重要的益生菌,可以净化肠内环境,调节人体胃肠道健康及微生态环境平衡[１Ｇ２],并可抑制致病菌的生长,对乳糖不耐症㊁消化不良及过敏刺激反应等均有一定的治疗功效[３Ｇ４]．此外,在一定程度上可以激活机体体液免疫机制,降低肿瘤的发生率[５]．近几年随着对乳酸菌的深入研究,其在农业㊁食品㊁生物㊁医学等领域的应用价值更益突显．乳酸菌胞外多糖(E x o p o l ys a c c h a r i d e ,E P S )是乳酸菌在生长代谢过程中发酵产生并分泌到细胞壁外的次级代谢物的总称[６],一般为黏液或荚膜多糖等水溶性多糖,是一种天然高分子聚合物[７]．作为一种安全的功能性产物,乳酸菌胞外多糖因其双重理化功能,越来越广泛地被应用于食品工业及医疗领域中[８]．在生理功能上,胞外多糖具有良好的抗肿瘤㊁保护机体组织细胞㊁增强免疫抵抗力和降低胆固醇等活性[９]．在物化特性上,作为一种新型天然食品添加剂,E P S 对于酸乳及豆制品的流变性㊁乳化性㊁黏着性都有显著影响,极大地提高了其质构㊁凝胶和流变性能,缓解了乳清分离㊁结构脆弱等问题,使其变得更加细腻,鲜嫩爽滑,从而大大增加酸乳及豆制品的口感,提高风味,乳酸菌E P S 有广阔的工业应用价值[１０Ｇ１１]．目前用于发酵生产酸乳的大部分菌株稳定性差,产糖能力弱,E P S 在工业生产中规模性应用受到极大限制．因此乳酸菌E P S 产量的提高是目前急需解决的难题．要想解决这一难题,就必须筛选高产菌株并就其培养条件进行优化．本研究以实验室菌种库保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定它们的产胞外多糖的能力,获取产胞外多糖能力最强的目标菌株,再通过单因素试验设计㊁B o x ＧB e h n k e n 试验设计,以胞外多糖含量作为响应值,对影响因素进行优化分析,以求得培养条件的最优组合．1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂乳酸菌来源:本实验室菌种库保藏的４３株乳酸菌．M R S 培养基,胞外多糖筛选培养基．主要试剂:三氯乙酸㊁硫酸㊁乙酸乙酯㊁蒽酮等,均为国产分析纯试剂,购买于国药集团．1.2㊀仪器与设备S H P Ｇ２５０型生化培养箱(上海三发科学仪器有限公司);１Ｇ１５P K 离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);B B S ＧS D C ＧA 超净工作台(博科生物公司);７２２型可见光分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)．1.3㊀实验方法１．３．１㊀葡萄糖标准曲线的绘制㊀精密移取葡萄糖标准液０．０m L㊁２．０m L㊁４．０m L㊁６．０m L㊁８．０m L㊁１０．０m L于试管中,加蒸馏水稀释１００倍,并从中取１．０m L稀释液于２５m L的具塞试管中,再各加６％苯酚溶液１．５m L振荡摇匀,沿着玻璃棒缓慢加入５m L浓硫酸,摇匀,静置１０m i n．再放于水浴锅沸水加热２０m i n,拿出冷却放置至室温,在４９０n m处,对照测定标准液的吸光度[１２]．葡萄糖的标准曲线如图１所示．图１㊀葡萄糖的标准曲线１．３．２㊀胞外多糖的提取㊀将供试乳酸菌活化后接种到胞外多糖M R S液体筛选培养基中,３０ħ静置培养４８h,取１０m L培养液于试管中,并加入２m L８０％的三氯乙酸,置冰浴中搅拌振荡３０m i n后于４ħ㊁６０００g下离心３０m i n,吸取上清液于灭菌过的５０m L的离心管中,再加入３倍体积的冰冻无水乙醇,放置在４ħ冰箱中冷藏．第２天取出,最终可以观测到多糖呈乳白色絮状沉淀析出,再于４ħ㊁６０００g下离心３０m i n,用１０m L 蒸馏水溶解沉淀,可得胞外多糖提取液[１３]．１．３．３㊀胞外多糖的测定㊀用移液枪吸取１m L 胞外多糖粗提取液于试管中．稀释到合适倍数,吸取１m L稀释液于２０m L的具塞试管中．另取１m L蒸馏水作为试剂空白参比,然后分别添加０．５m L的蒽酮试剂．随后沿璃棒缓缓加入５m L浓硫酸,盖上塞子后,充分摇匀,再沸水浴１０m i n,冷却至室温后,在波长６２０n m下测定提取液O D 值,并根据葡萄糖标准曲线回归方程计算胞外多糖的含量．１．３．４㊀培养条件的优化(１)接种量对菌株产E P S的影响将筛选的菌株活化后,调节M R S液体培养基初始p H为６．２,然后以２％㊁３％㊁４％㊁５％㊁６％５个水平的接种量分别接种到培养基中,３７ħ恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．不同的接种量重复３次实验,取其平均值．(２)不同碳源对菌株产E P S的影响改变M R S培养基中的碳源,将碳源分别更改为葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁果糖和麦芽糖,并调节培养基初始p H至６．２,以３％接种量接至改良的M R S培养基中,３７ħ下恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个水平重复３次实验,取其平均值．(３)碳源浓度对菌株产E P S的影响改变M R S培养基中的乳糖浓度,将浓度分别设定为１０㊁２０㊁３０㊁４０㊁５０g/L,并调节培养基初始p H至６．２,以３％接种量接至改良的MR S培养基中,３７ħ下恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个水平重复３次实验,取其平均值．(４)发酵温度对菌株产E P S的影响将MR S培养基的碳源更换为乳糖,浓度设置为４０g/L,并调节初始p H至６．２,活化菌株后以３％接种量接至改良过的M R S液体培养基中,分别置于２３㊁３０㊁３７㊁４４㊁５１ħ的培养箱中,恒温培养４８h,测定培养液中E P S含量．每个培养温度重复３次实验,取其平均值[１４Ｇ１５]．2㊀结果与讨论2.1㊀高产胞外多糖菌株的筛选以实验室保藏的４３株乳酸菌为筛选源,测定其产胞外多糖的能力,结果如表２所列．由表２易知,在４３株乳酸菌中,菌株２Ｇ２产E P S的能力最强,胞外多糖产量高达１０１２．６μg/ m L,该菌株经鉴定为植物乳杆菌,故以此菌为供试菌,优化其产胞外多糖的条件．2.2㊀乳酸菌产EPS培养条件的优化２．２．１㊀接种量对产E P S结果影响㊀为探究不同接种量对乳酸菌株产E P S能力的影响,本次试验设定２％㊁３％㊁４％㊁５％㊁６％不同水平的５个接种量,利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,所得结果如图２所示．由图２可知,接种量在２％~３％时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力呈上升趋势,这是因为当接种量适当增加时,植物乳杆菌２Ｇ２生长增殖周４５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀兰州文理学院学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３４卷表２㊀乳酸菌株产E P S 的能力菌株来源O D 值胞外多糖含量/(μg /m L )菌株来源O D 值胞外多糖含量/(μg /m L )植伊利牛奶０．２１０６１８．５３５Ｇ２腌空心菜０．１８２５３６．１８A Ｇ１酸菜０．１７８５２４．４２５Ｇ３腌空心菜０．２６１７６８．５３B 腌泡椒０．１３４３９５．００５Ｇ４腌空心菜０．１５７４６２．６５C 酱瓜０．３１８９３６．１８６君乐宝纯享０．２２３６５６．７６D酸辣白菜０．１６４４８３．２４６Ｇ２萝卜１０．２２４６５９．７D Ｇ１酸辣白菜０．１９６５７７．３５６Ｇ３萝卜１０．２９６８７１．４７J Ｇ１黄豆０．１９０５５９．７０６Ｇ４萝卜１０．１７８５２３．５３Q ３蒜头汁０．１４６４３０．２９７Ｇ１萝卜２０．２２４６５９．７１Q ４蒜头汁０．１９５５７４．４１７Ｇ２萝卜２０．１４９４３９．１２P T Ｇ１酸菜汁０．１７６５１８．５３８白伊利牛奶０．１６６４８９．１２P T Ｇ２酸菜汁０．１６４４８３．２４９蓝君乐宝０．１７７５２１．４７１Ｇ１豆腐乳０．２６３７７４．４２１０Ｇ１泡菜０．２１５６３３．２４２蓝蒙牛优益C ０．１６６４８９．１２１１Ｇ２泡菜０．１４８４３６．１８２Ｇ１腌豆角０．１６３４８０．２９１１Ｇ３泡菜０．１４８４３６．１８２Ｇ２腌豆角０．３４４１０１２．６１２Ｇ１泡菜０．１７０５００．８８３蒙牛优益C ０．２７８８１８．５３１２Ｇ４泡菜０．１４２４１８．５３３Ｇ１腌雪菜０．１２９３８０．２９１３Ｇ２泡菜０．１９０５５９．７１３Ｇ３腌雪菜０．２１６６３６．１８１４Ｇ１泡菜０．１７３５０９．７１４黄养乐多０．２４８７３０．２９１４Ｇ２泡菜０．１８７５５０．８８４Ｇ４腌辣椒０．１８８５５３．８２１５Ｇ２菌粉０．１７３５０９．７１５蒙牛冠益乳０．２３１６８０．２９１７Ｇ１菌粉０．２２６６６５．５９５Ｇ１腌空心菜０．１７８５２４．４１图２㊀不同接种量下的E P S 产量期相应缩短,菌液浓度增大,从而使发酵液中的E P S 产量提高,当接种量为３％时,其产胞外多糖的含量最多,高达４２７μg /m L ;当接种量位于３％~６％时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力呈下降趋势,这是因为当接种量持续增加时,过高的菌液浓度会争夺培养基中的营养物质,尤其在增殖培养后期会有一部分菌体因培养基中养分不足而不断死亡,从而影响菌株产胞外多糖的能力;当接种量为６％时,其产胞外多糖的含量最少,为２２２．５μg /m L ．因此,植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖的最佳接种量为３％．２．２．２㊀不同碳源对产E P S 结果影响㊀碳源是微生物培养基必须成分,培养基中碳源的不同会导致乳酸菌产胞外多糖量的差异[１６Ｇ１７]．目前微生物可利用的碳源主要为木糖㊁葡萄糖㊁半乳糖㊁果糖㊁麦芽糖㊁乳糖㊁蔗糖等,本次优化碳源试验中,将碳源设置为葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁果糖和麦芽糖,分别探究其对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的影响．利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S 的产量,所得结果如图３所示．由图３易知,当碳源为乳糖时,菌株２Ｇ２产E P S 的能力最大,产量为５８１．３２μg/m L ,显著高于其他碳源产E P S 浓度．然而对于从多宝鱼肠道分离的菌株L a c t o b a c i l l u s pl a n t a r u m Ｇ１２[１５],当碳源为蔗糖时胞外多糖合成量最高;对于菌株L ．k e f i r a n o f a c i e n s [１６],当乳糖为碳源时,其产胞外多糖的能力最好;而对于植物乳杆菌YM Ｇ２[１７],当碳５５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化图３㊀不同碳源下的E P S产量源为葡萄糖时,菌株代谢产E P S的量最多．从这些文献可以看出,不同的菌株,其最佳碳源也会不同,碳源的利用具有菌株差异性．根据本次实验研究,获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最优碳源为乳糖．２．２．３㊀不同乳糖浓度对产E P S结果影响㊀为探究不同乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响,本次试验设定１０㊁２０㊁３０㊁４０㊁５０g/L５个不同水平的浓度,利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,所得结果如图４所示．图４㊀不同乳糖浓度下的E P S产量由图４可知,乳糖浓度在１０~４０g/L时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力逐级增强,当浓度为４０g/L时,菌株产胞外多糖的量最多,高达７２６．４μg/m L．这是因为随着乳糖浓度的提高,培养基中充分的营养物质为植物乳杆菌２Ｇ２的增殖培养提供优良环境,提高了其新陈代谢速度,从而使菌株２Ｇ２发酵液中的胞外多糖产量逐渐增加;但乳糖浓度在４０~５０g/L时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力急剧降低,当浓度为５０g/L时,菌株产胞外多糖的量最少,为４９３．０９μg/m L．这是因为培养基中营养物质(乳糖)浓度过高,会使培养基的渗透压太高,导致细胞脱水,抑制植物乳杆菌２Ｇ２的生长,从而影响其产E P S的能力．因此根据本次试验研究,可以获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最适乳糖浓度为４０g/L．２．２．４㊀不同温度对产E P S结果影响㊀为探究不同的发酵温度对菌株产E P S含量的影响,本实验利用蒽酮Ｇ硫酸法测定活化后的植物乳杆菌２Ｇ２产多糖溶液的吸光度值,并代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算E P S的产量,结果如图５所示．图５㊀不同温度下的E P S产量由图５可得,随着培养温度的不断上升,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力呈先上升后降低趋势,当培养温度为３７ħ时,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力最强,合成量为７３１．２８μg/m L;５１ħ时E P S含量最低,为４８９．７２μg/m L．这是因为温度与微生物生长代谢之间密切相关,当处于适宜温度下,乳酸菌生长迅速,发酵性能强,从而产E P S 的能力也会相应提高;当超出适宜温度范围时,乳酸菌增殖代谢速率降低,发酵性能降低,甚至会有个别细菌因过高的温度而失活,从而影响菌株产E P S的能力．因此根据本次试验研究,可以获知植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的最适温度为３７ħ．2.3㊀响应面实验分析２．３．１㊀回归方程的参数分析㊀本次试验以接种量㊁乳糖浓度㊁温度３个培养因素进行优化分析,根据上述单因素试验结果,可知当接种量为３％㊁碳源为乳糖㊁浓度为４０g/L㊁温度为３７ħ时植物乳杆菌２Ｇ２产胞外多糖的含量最多．因此将这些条件作为基础条件来采用B o xＧB e h n k e n法进行进一步的优化,其优化方法可见表３．选择好各试验因素的含量之后,按照表３进行实验,再利用软件D e s i n gＧE x p e r８．０．６设计出组合试验,数据可见表４．再根据R S A软件对数据进行分析,分析结果如表５．在响应面优化设计中,F值反映的是不同变量与响应值之间的拟合程度,F值越高,表明模型６５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀兰州文理学院学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３４卷表３㊀B o xＧB e h n k e n法因素选择与含量水平接种量/％浓度/(g/L)温度/ħ－１２．５０３５．００３５．０００３．００４０．００３７．００＋１３．５０４５．００３９．００的显著性好;而P值反映的是不同变量对响应值的影响程度,P值越小,表明该因素对响应值的影响程度更大．由表５可知,F模型＝３０．１１,P＜０ ００１时,模型为显著;失拟项F＝２．４１,P＝０ １５２０＞０．０５时,不显著,因此模型建立有效．此外,从表５分析结果还获知在接种量㊁乳糖浓度㊁培养温度３个培养条件中,乳糖浓度的F模型最大,P值最小,模型显著,对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响程度最大;相反,菌株接种量的F模型最小,P值最大,模型不显著,对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响程度最小．因此各因子对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响顺序为:乳糖浓度＞接种量＞培养温度[１８]．２．３．２㊀响应曲面实验分析㊀接种量与浓度交互对E P S产量的影响如图６,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力随接种量和乳糖浓度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于接种量,乳糖浓度的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,接种量与浓度的交互作用对E P S产量的影响不显著．表４㊀中心组合实验的设计和结果实验号A接种量/％B乳糖浓度g/LC发酵温度/ħY胞外多糖(μg/L)１３．００４５．００３５．００１１４５．５０２３．００４０．００３７．００１１３１．３２３３．００３５．００３９．００６６２．２１４２．５０４０．００３９．００６７７．９４５３．５０３５．００３７．００６７３．９７６３．００３５．００３５．００１３６９．４４７２．５０４５．００３７．００１００６．３２８３．５０４０．００３９．００９２８．３８９２．５０３５．００３７．００７２５．３８１０３．５０４０．００３５．００６０６．３２１１３．５０４５．００３７．００１１０３．２４１２２．５０４０．００３５．００９８３．７１１３３．５０４５．００３９．００１４９８．９１表５㊀中心组合实验结果分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型１．３E＋００６９１．３E＋００５３０．１１＜０．０００１显著A２６６１９．４５１２６６１９．４５６．３５０．０３０４B２．８E＋００５１２．８E＋００５６４．００＜０．０００１显著C３２１５．５７１３２１５．５７０．７７０．４０１７A B７４４６．４５１７４４６．４５１．７８０．２１２１A C７９９１０．４６１７９９１０．４６１９．０６０．００１４显著B C２．８E＋００５１２．８E＋００５６６．８４＜０．０００１显著A２５．１E＋００５１５．１E＋００５１２０．９０＜０．０００１显著B２１９４００．８８１１９４００．８８４．６３０．０５６９C２３３９７．６５１３３９７．６５０．８１０．３８９１残差４１９１６．０４１０４１９１．６０失拟误差２１３１１．５４３７１０３．８５２．４１０．１５２０不显著纯误差２０６０４．５０７２９４３．５０总变异１．２E＋００６１９接种量与温度交互对E P S产量的影响如图７,植物乳杆菌２Ｇ２产E P S的能力随接种量和温度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于温度,接种量的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此接种量对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,接种量与温度的交互作用对E P S产量的影响显著．浓度与温度交互对E P S产量的影响如图８,７５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 的能力随乳糖浓度和温度的增加呈先上升后降低趋势．其中,相对于温度,乳糖浓度的响应曲面坡度更加陡峭,变化更加显著,因此乳糖浓度对植物乳杆菌２Ｇ２产E P S 能力的影响更为显著．并且由表５方差分析结果可知,乳糖浓度与温度的交互作用对E P S 产量的影响显著．图６㊀接种量与浓度交互对E P S产量的影响图７㊀接种量与温度交互对E P S产量的影响图８㊀浓度与温度交互对E P S 产量的影响3㊀结论根据上述实验探究得到产E P S 最佳工艺参数:接种量为３．５％,温度为３９ħ,最佳碳源为乳糖,其最适浓度为４５g /L ,E P S 产量能够达到１４９８．９１μg /m L ．按照上述条件实验进行３次重复试验,其误差在５％以内,说明该模型能够较好地模拟其发酵过程中E P S 的含量变化．参考文献:[１]唐京,陈明,柯文灿,等．乳酸菌在疾病防治和人体保健中的应用研究进展[J ]．微生物学杂志,２０１７,３７(４):９８Ｇ１０７．[２]华鹤良．乳酸菌的分离鉴定及其抗菌肽与发酵性能研究[D ]．扬州:扬州大学,２０１４．[３]MA J AMA A H ,I S O L A U R IE ,S A X E L I N M ,e t a l ．L a c t i c a c i db a c t e r i a i n t h e t r e a t m e n t o f a c u t e r o t a v i r u s ga s t r o e n t e r i t i s [J ]．J P e d i a t r G a s t r N u t r ,１９９５,２０(３):３３３Ｇ３３８．[４]黄承敏,肖茜,王蓉蓉,等．一株高产胞外多糖乳酸菌的分离鉴定及其产胞外多糖的研究[J ]．中国酿造,２０１９,３８(１):８０Ｇ８３．[５]袁起伟,郝凤奇,杨文涛,等．乳酸菌抗肿瘤作用的研究进展[J ]．食品科学,２０１１,３２(９):３０３Ｇ３０６．[６]张玉龙,胡萍,王金龙,等．产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究[J ]．中国酿造,２０１５,３４(１０):３７Ｇ４２．[７]汪清美,赵丽平．乳酸菌胞外多糖的结构及益生功能研究进展[J ]．天津农业科学,２０１５,２１(５):１９Ｇ２２[８]叶广彬,陈源红,王长丽,等．柠檬明串珠菌T D １产胞外多糖条件的响应面法优化及其抗氧化性研究[J ]．中国酿造,２０１８,３７(１１):７０Ｇ７５．[９]孟凡岭,万姝含,胡风庆．乳酸菌胞外多糖生物活性研究进展[J ]．辽宁大学学报(自然科学版),２０１８,４５(４):３７９Ｇ３８４．[１０]杨靖鹏,王静,张晓辉,等．乳酸菌胞外多糖研究进展以及在食品工业中的应用[J ]．食品与发酵工业,２０１６,４２(１):２６４Ｇ２７２．[１１]冯美琴．植物乳杆菌胞外多糖发酵㊁结构鉴定及其功能特性研究[D ]．南京:南京农业大学,２０１２．[１２]熊芳,孙淑静,肖颖,等．６种食用菌菌丝体多糖含量的比较[J ]．食品研究与开发,２０１２,３３(８):２７Ｇ３１．[１３]姚沛琳．乳酸菌抑制变异链球菌生物膜形成的研究[D ]．无锡:江南大学,２０１５．[１４]刘燕．高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究[D ]．郑州:河南农业大学,２００９．[１５]刘雯雯,孙梦莹,刘丽娜,等．L a c t o b a c i l l u s p l a n t a Ｇr u m Ｇ１２菌株胞外多糖培养条件优化及功能特性研究[J ]．食品研究与开发,２０１８,３９(７):１８０Ｇ１８６．[１６]C H E I R S I L PB ,S H I M I Z U H ,S H I O Y AS ．M o d e l Ｇl i n g a n do pt i m i z a t i o no f e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s f o r k e f i r a n p r o d u c t i o n b y L a c t o b a c i l l u s k e f i Ｇr a n o f a c i e n s [J ]．A p p l i e dM i c r o b i o l o g y &B i o t e c h n o l o g y ,２００１,５７(５/６):６３９Ｇ６４６[１７]司天昭,柳陈坚,秦晓萌,等．植物乳杆菌YM Ｇ２菌株胞外多糖生物合成工艺优化[J ]．食品科学,２０１７,３８８５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀兰州文理学院学报(自然科学版)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３４卷(１０):２４Ｇ３０[１８]李莉,张赛,何强,等．响应面法在试验设计与优化中的应用[J ]．实验室研究与探索,２０１５,３４(８):４１Ｇ４５．[责任编辑:纪彩虹]S c r e e n i n g o fL a c t i cA c i dB a c t e r i aw i t hH i ghE x t r a c e l l u l a r P o l y s a c c h a r i d eC a p a c i t y a n dO pt i m i z a t i o no fC u l t u r eC o n d i t i o n s K O N G D e Ｇh u i ,J I A N GJ i a Ｇx u a n(S c h o o l o fB i o l o g i c a l a n dF o o dE n g i n e e r i n g ,S u z h o uU n i v e r s i t y,S u z h o u２３４０００,A n h u i ,C h i n a )A b s t r a c t :T h e ４３s t r a i n s o f l a c t i c a c i db a c t e r i ad e p o s i t e d i n t h i s l a b o r a t o r y w e r eu s e da s t h e s c r e e n i n gs o u r c e t od e t e r m i n e t h e i ra b i l i t y t o p r o d u c ee x t r a c e l l u l a r p o l ys a c c h a r i d e s ．T h eL a c t o b a c i l l u s p l a n t a Ｇr u m２Ｇ２h a d t h e s t r o n g e s t a b i l i t y t o p r o d u c e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ,w i t ha no u t pu t o f １０１２．６μg /m L ．F o r t h e t e s tb a c t e r i a ,t h e r e s p o n s es u r f a c em e t h o dw a su s e dt oo p t i m i z e t h ec o n d i t i o n s f o r p r o d u c i n g e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ．T h r o u g ha s i n g l e f a c t o r e x pe r i m e n t ,t h e ef f e c t so f s t r a i n i n Ｇo c u l a t i o n a m o u n t ,c u l t u r e t e m pe r a t u r e ,d if f e r e n t c a r b o n s o u r c e s a n d c o n c e n t r a t i o n s o n t h e p r o d u c t i o n o fe x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sw e r e i n v e s t ig a t e d ．O nthi sb a s i s ,t h er e s p o n s es u r f a c e m e t h o d w a s u s e d t o f u r t h e r o p t i m i z e t h e c o n d i t i o n s f o r t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l ys a c c h a r i d e s ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e m a j o r f a c t o r sa f f e c t i n g th e p r o d u c t i o no fL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ２Ｇ２e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sw e r e l a c t o s e c o n c e n t r a t i o n ＞i n o c u l a t i o n a m o u n t ＞c u l t i v a t i o n t e m p e r a t u r e ,t h e o p t i m a l o p t i m i z a t i o n c o n d i t i o n sw e r e l a c t o s e４５g /L ,i n o c u l a t i o na m o u n t ３．５％,c u l t u r e t e m pe r a t u r ew a s３９ħ,a n d t h e y i e l dof e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e u n d e r t h i s c o n d i t i o nw a s １４９８．９１μg/m L ,w h i c hw a s １．４８t i m e s t h a t b e f o r e o pt i m i z a t i o n ．K e y wo r d s :l a c t i c a c i db a c t e r i a ;e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ;r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ９５第３期孔德卉等:高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化。
产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究
产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究张玉龙;胡萍;王金龙;廖乾伟【摘要】以分离自贵州侗族、苗族传统发酵食品的36株乳酸菌为受试菌,筛选出8株高产胞外多糖(膜截留分子质量为8 000～14 000u)的乳酸菌,分别为SR2-1 (Pediococcus sp.F3S1)、SR2-2 (Pediococcuspentosaceus NGRI0304)、SR3-2 (Pediococcus pentosaceus LB-WC)、SR8 (Lactobacillus kimchi)、SR10-2 (Pediococcus sp.22-4)、SR 12-1 (Lactobacillus graminis)、H1 (Staphylococcus sp.3034O2)和XS2 (Pe-diococcus pentosaceus GS17),并对其胞外多糖进行体外抗氧化特性研究.结果显示,8株乳酸菌的胞外多糖均具有抗氧化活性,其中胞外多糖质量浓度为30μg/mL时,乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖对Fe2+的清除率分别为15.55％、12.41％、53.21％;胞外多糖质量浓度为40 μg/mL时,乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和NO2-的清除率分别达9.69％、11.93％、8.93％及5.73％、7.82％、3.82％.这三株乳酸菌显示出一定的抗氧化活性.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2015(034)010【总页数】6页(P37-42)【关键词】乳酸菌;胞外多糖;抗氧化【作者】张玉龙;胡萍;王金龙;廖乾伟【作者单位】贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】TS201.3乳酸菌是普遍公认的食品安全（generally regarded as safe，GRAS）微生物，在自然界广泛分布，其具有调节人体肠道微生态［1-2］、调节免疫力［3-4］、抗氧化［5-6］、降胆固醇［7-8］、抗肿瘤［9-10］、抗过敏［11-12］、降血压［13］、降血脂［14］等功能。
高产胞外多糖植物乳杆菌筛选及其发酵工艺优化
高产胞外多糖植物乳杆菌筛选及其发酵工艺优化张文平; 赵英杰; 罗晟; 程新【期刊名称】《《食品与发酵工业》》【年(卷),期】2019(045)021【总页数】8页(P38-45)【关键词】植物乳杆菌; 胞外多糖; 条件优化; Plackett-Burman设计; 响应面法【作者】张文平; 赵英杰; 罗晟; 程新【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌 330045【正文语种】中文乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一种糖类高聚物的总称[1-2]。
大量研究表明，乳酸菌胞外多糖具有多种生理功能，如抗氧化、抗肿瘤、促进肠道菌群平衡、免疫调节等[3]，此外，乳酸菌胞外多糖可以作为一种天然的食品添加剂，改善食品黏稠度、质地和风味等[4]，因此被广泛应用于食品、医药等领域[5-7]。
目前，乳酸菌胞外多糖的产量普遍偏低，这也是制约着其大规模工业化生产的主要原因之一[8-9]。
基于此，近年来，大多数研究都集中在如何进一步优化乳酸菌胞外多糖产量[10-12]。
叶广彬等[13]采用响应面法优化柠檬明串珠菌TD1产胞外多糖条件，优化后产量是优化前的1.76倍。
WANG等[14]对Lactobacillus plantarum KX041合成胞外多糖的发酵条件进行响应面法优化，优化后，最大胞外多糖产量达到599.52 mg/L，是优化前的3倍。
因此，优化菌株营养和培养条件是提高乳酸菌胞外多糖产量的重要途径。
本实验以提高胞外多糖产量为出发点，从课题组保藏的20株乳酸菌中筛选高产胞外多糖的乳酸菌，采用形态学、生理生化和分子生物学手段对菌株进行鉴定，同时，采用单因素和响应面实验进行优化，确定最佳发酵工艺条件，为乳酸菌胞外多糖的工业化生产提供一定的理论基础和技术手段。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株乳酸菌，江西农业大学微生物资源开发与利用实验室保藏。
1.1.2 培养基MRS培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，无水乙酸钠5.0 g/L，MgSO4 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃高压灭菌，15 min。
产胞外多糖乳酸菌的筛选及鉴定
基金项目：湖南省自然科学青年基金项目（编号：２０２１ＪＪ４０２４２）作者简介：陈靖，男，湖南农业大学在读硕士研究生。
通信作者：周辉（１９８０—），男，湖南农业大学副教授，博士。
Ｅ ｍａｉｌ：ｐａｒａｄｉｓｅ９１７＠１６３．ｃｏｍ收稿日期：２０２２ １１ ２３ 改回日期：２０２３ ０３ ２２犇犗犐：１０．１３６５２／犼．狊狆犼狓．１００３．５７８８．２０２２．８１０９１［文章编号］１００３ ５７８８（２０２３）０４ ００２６ ０６产胞外多糖乳酸菌的筛选及鉴定Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ陈 靖１犆犎犈犖犑犻狀犵１ 周佳豪１犣犎犗犝犑犻犪 犺犪狅１ 毛琪琪１犕犃犗犙犻 狇犻１ 唐 霞２犜犃犖犌犡犻犪２ 刘成国１，３犔犐犝犆犺犲狀犵 犵狌狅１，３ 周 辉１，３犣犎犗犝犎狌犻１，３（１．湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 ４１０１２８；２．皇氏集团湖南优氏乳业有限公司，湖南长沙 ４１０００８；３．湖南农业大学长沙现代食品创新研究院，湖南长沙 ４１０１２８）（１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犎狌狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１０１２８，犆犺犻狀犪；２．犎狌犪狀犵狊犺犻犌狉狅狌狆犎狌狀犪狀犢狅狌狊犺犻犇犪犻狉狔犆狅．，犔狋犱．，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１０００８，犆犺犻狀犪；３．犆犺犪狀犵狊犺犪犐狀狀狅狏犪狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲犳狅狉犉狅狅犱狅犳犎狌狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１０１２８，犆犺犻狀犪）摘要：目的：筛选出产胞外多糖能力强的乳酸菌菌株。
方法：从实验室分离保藏的乳酸菌中挑选４０株乳酸菌，以商业菌株鼠李糖乳杆菌（犔．狉犺犪犿狀狅狊狌狊ＧＧ，ＬＧＧ）为阳性对照菌株，采用菌落拉丝法和苯酚—硫酸法筛选出胞外多糖产量高的菌株，对其进行体外抗逆性、安全性和抗生素敏感性试验，并对最终得到的菌株进行表型特征分析和种属鉴定。
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》范文
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌作为益生菌的一种，具有调节肠道菌群平衡、增强免疫力等重要功能。
其中，乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）作为乳酸菌的重要代谢产物，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等。
因此，对乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究具有重要的理论和实践意义。
本文旨在通过实验研究，探讨乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化方法及其免疫活性的作用机制。
二、材料与方法1. 材料（1）菌种：选择不同种属的乳酸菌进行实验。
（2）培养基：根据实验需要，配置不同的培养基。
（3）试剂：如乙醇、丙酮、硫酸铵等。
2. 方法（1）筛选方法：采用薄层层析法、紫外-可见光谱法等手段，对乳酸菌产生的EPS进行筛选。
（2）纯化方法：通过醇沉法、硫酸铵沉淀法等方法对EPS 进行纯化。
（3）免疫活性研究：采用体外实验和动物实验相结合的方法，观察EPS对免疫细胞的刺激作用，评估其免疫活性。
三、实验结果1. EPS的筛选结果通过薄层层析法、紫外-可见光谱法等手段，成功筛选出具有较高EPS产量的乳酸菌菌株。
经过对比分析，发现不同菌株产生的EPS在化学组成和分子量等方面存在差异。
2. EPS的纯化结果采用醇沉法、硫酸铵沉淀法等方法对EPS进行纯化。
经过纯化后的EPS，其纯度得到显著提高，为后续研究提供了可靠的实验材料。
3. 免疫活性研究结果（1）体外实验：通过观察EPS对免疫细胞的刺激作用，发现EPS能够显著提高免疫细胞的活性，促进细胞因子的分泌。
（2）动物实验：通过观察EPS对动物免疫功能的影响，发现EPS能够显著提高动物的免疫力，增强机体的抗病能力。
此外，EPS还具有抗肿瘤作用，能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
四、讨论通过对乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究，我们得出以下结论：1. 不同菌株产生的EPS在化学组成和分子量等方面存在差异，这可能与菌株的遗传特性、培养条件等因素有关。
新疆酸马奶中高产胞外多糖乳酸菌筛选鉴定及培养条件优化研究
养条件 的优化试验中 ， 采用单次单 因子法 ， 探索初始 ｐ Ｈ值 、 培养时间 、 碳源及氮源等 对乳酸菌 产胞外多糖 量 的影 响。【 结论 】 鉴定 出产胞外多糖量高的乳酸菌为干酪乳 杆菌 ， 并且 确定干酪乳杆 菌产胞外 多糖 的最佳 合
成 条 件 为 葡 萄 糖 ２ ， 白胨 １５ ， 酵 时 间 ２ ， 始 ｐ ％ 蛋 ．％ 发 ８ｈ初 Ｈ值 ６５ 此条 件 下 所 合 成胞 外 多 糖 量 为 １ １６ｍ ／ ．， ２ ． ｇ
Ａ ｓ ａｔ【 ｂｅｔ ｅ Ａ ｌ ｔ ｃ ａ ｅａ ｉ ｉ Ｐ ｐ ｄｃ ｇ ａａｉ ａ ｓ ｅｎｄｆ ｍ ｋｕ ｂｔ ｃ：Ｏ ｊｃｖ 】 ｃｃ ｉ ｂｃ ｒ ｔ ｈ ｈＥ Ｓ— ｒ ｕｉ ｐｃｙ ｓ ｃ ｅｅ ｏ ｏ— ｒ ｉ ａ ｉａ ｄ ｔｉｗ ｈ ｇ ｏ ｎｃ ｔｗ ｒ ｒ
产胞外多糖乳酸菌的筛选及其多糖的结构研究
产胞外多糖乳酸菌的筛选及其多糖的结构研究乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在菌体生长、代谢过程中产生并分泌到细胞外、常常渗透到培养基中的荚膜多糖或粘液多糖。
乳酸菌EPS不仅具有良好的流变学特性,还具有重要的生理活性,如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、益生作用等。
我国拥有丰富的乳酸菌发酵食品,包括产胞外多糖在内的乳酸菌资源尚未得到有效开发。
本文对酸菜中产胞外多糖的乳酸菌进行高效快速地筛选,纯化胞外多糖,对其结构和理化特性进行研究。
以家庭自制东北酸菜为样品,采用产粘菌落法与多糖产量相结合的方法,筛选到两株产EPS较高的菌株NM105和2-19,经过形态学观察、生理生化和16S rDNA 手段对这两株菌进行了系统鉴定,判定这两株菌均属于明串珠菌属,分别命名为Leuconosto citreum NM105和L.mesenteroides subsp.dextranicum 2-19。
将两株菌分别接种至含5%蔗糖的MRS培养基中,25℃培养48 h,得到产EPS的发酵液,经离心、除蛋白、醇沉、透析得到粗多糖的水溶液。
粗多糖再经凝胶过滤层析纯化得到均一的多糖组分,冷冻干燥得到纯多糖,产量分别为23.5g/L和11.4 g/L。
结合紫外分析、高效体积排阻色谱分析,两株菌所产多糖均不含核酸和蛋白,重均分子量Mw分别为1.01×108 Da和8.79×107 Da。
采用气相色谱和薄层色谱分析单糖组成,结果表明两株菌所产EPS均只含葡萄糖。
结合单糖组成分析、红外光谱分析、核磁共振光谱分析,L.citreum NM105所产EPS含有三种糖单元,分别为[→6)-α-D-Glcp-(1→]、[α-D-Glcp-(1→]和[→2,6)-α-D-Glcp-(1→],摩尔比接近1:1:1,是一种带有高含量的α-(1→2)糖苷键的支链多糖。
而L.mesenteroides subsp.dextranicum 2-19所产EPS是一种由α-(1→6)糖苷键连接的高度线性葡聚糖。
传统奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选及其潜在益生菌特性
进 行 测序 ， 将 测 序 结 果 与 ＮＣ ＢＩ 数 据 库 中 的 核 酸 序 列 进 行 比对 。 将所测 菌株的 １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ 序 列 用 Ｂ ｌ ａ ｓ ｔ 软 件 在 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 数 据 库 中进 行 相 似性 比较 ， 选 取 同源 性 较高 的相 关 菌 株 的 １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ区 域 序 列 作 为 参 比 对 象 ， 采 用 ＭＥＧＡ５ ． ０ 软 件构 建 系统 发育树 。 １ ． ４ ． ２ 产 胞 外 多糖 乳 酸 茵 的 筛选 （ １ ） 胞 外 多 糖 标 准 曲 线 的绘 制 。 葡 萄 糖 标 准 曲 线
式 中 ：Ａ。 为 菌 液 与 吸 附剂 混 匀 前 的吸光 度 ； Ａ为 菌液 与 吸附剂 混匀 后 的吸光 度 。 １ ． ４ ． ６ 菌株 的 体 外 降 胆 固 醇 能 力 测 定 将待 测 菌 株 依 次传 代 活 化 ３ 代后 使 其 恢 复活 力 ， 按体积分数为 ３ ％接 种 于 含 有 质 量 浓 度 约 １ ０ ０￣ ｇ ／ ｍＬ 胆 固 醇 的 ＭＲＳ － ＴＨＩ Ｏ 培养 基 中 ， ３ ７℃ 恒 温 培 养 ２ ４ ｈ 后， 采 用 邻 苯 二 甲醛 比色 法 测 定 培 养 基 中 残 留 胆 固
酶 冷却 的发 酵 液 中加 入 质量 浓度 为 ８ ０ ０ ｇ ／ Ｌ的 三 氯 乙
将培养 后 的菌液离 心（ ６ ０ ０ ０ ｇ， ４ ｏ Ｃ， １ ０ ａｉ ｒ ｎ ） ， 取上 清液 ０ ． ５ ｍＬ于 １ ８ ｍｍｘ １ ８ ｃ ｍ试 管 中 ， 依 次加 入 ３ ｍＥ 体积分 数为 ９ ５ ％的 乙醇 和 ２ ｍＬ质 量 浓 度 为 ０ ． ５ ｇ ／ ｍＬ的 氢 氧化钾 溶液 ， 漩涡 震荡 混匀后 置 于 ６ ０℃ 水 浴 中皂 化 １ ０ ｍｉ ｎ， 迅 速冷却 后 加入 ５ ｍＬ正 己 烷 ， 漩 涡震荡 １ ｍｉ ｎ 进行 萃取 ， 静置 １ ０ ａｉ ｒ ｎ后 加 入 ３ ｎ １ Ｌ水 ， 重复震 荡 １ ｍｉ ｎ 后 在室 温下 静 置 １ ０ ｍｉ ｎ， 待分 层 后 取 ２ ． ５ ｍＬ正 己 烷 层 于 １ ５ ｍｍｘ１ ５ ｃ ｍ试 管 中 ， 置于 ６ ０℃ 水 浴 中 用 氮 气 吹 干溶 剂 ， 加入 ４ ｎ Ｌ邻 苯 二 甲醛 显 色 剂 ， 漩 涡震 荡 １ ｍｉ ｎ
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》范文
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌作为益生菌的一种，在维护人体健康方面具有重要作用。
其中，乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌分泌到细胞外的复杂糖类物质，具有诸多生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等。
因此，对乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究具有重要意义。
本文旨在探讨乳酸菌胞外多糖的筛选方法、纯化过程及其免疫活性的研究。
二、材料与方法1. 材料（1）菌种：从不同来源筛选的乳酸菌菌株。
（2）培养基：营养丰富的液体培养基。
（3）试剂：包括各类化学试剂、酶等。
2. 方法（1）乳酸菌胞外多糖的筛选：从不同来源的乳酸菌中筛选出产EPS的菌株。
（2）乳酸菌的培养及EPS的提取：将筛选出的菌株进行培养，并提取其EPS。
（3）EPS的纯化：采用透析、离心、柱层析等方法对EPS 进行纯化。
（4）免疫活性研究：通过体外实验和动物实验研究EPS的免疫活性。
三、实验结果1. 乳酸菌胞外多糖的筛选结果通过对比不同来源的乳酸菌产EPS的能力，成功筛选出若干高产EPS的菌株。
这些菌株具有较高的产EPS能力和稳定性。
2. EPS的提取与纯化结果通过培养这些高产EPS的乳酸菌，成功提取出EPS。
经过透析、离心、柱层析等纯化步骤，得到较为纯净的EPS。
3. 免疫活性研究结果（1）体外实验：通过细胞增殖实验、细胞因子分泌实验等手段，发现EPS具有刺激免疫细胞增殖、分泌细胞因子等免疫活性。
（2）动物实验：通过建立动物模型，观察EPS对动物免疫系统的影响。
结果表明，EPS能够显著提高动物的免疫力，增强抗病能力。
四、讨论本实验成功筛选出高产EPS的乳酸菌菌株，并对其EPS进行了提取与纯化。
通过体外实验和动物实验，证实了EPS具有显著的免疫活性。
这为进一步开发EPS作为免疫调节剂提供了理论依据。
此外，我们还需进一步研究EPS的结构与功能关系，以及其在人体内的生物利用度和安全性。
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》范文
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌作为一种益生菌，因其能够调节肠道微生态平衡，促进肠道健康而备受关注。
近年来，研究发现乳酸菌的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）在保持益生菌的生理功能中发挥着重要作用。
乳酸菌EPS具有提高机体免疫力、抗氧化、降血脂等多种生物活性。
因此，筛选出具有优良性能的乳酸菌EPS并研究其纯化及免疫活性具有重要意义。
二、乳酸菌胞外多糖的筛选1. 菌种来源本研究所用菌种来源于多种乳酸菌菌株，通过初步筛选，选择具有高产EPS特性的菌株进行深入研究。
2. EPS提取采用适宜的提取方法，如热水浸提法、有机溶剂浸提法等，从筛选出的乳酸菌中提取EPS。
提取过程中需注意温度、时间等条件对EPS产量的影响。
3. EPS纯化将提取得到的EPS进行纯化处理，包括脱盐、浓缩、透析等步骤。
在纯化过程中，可采用色谱法、超滤法等方法进一步纯化EPS。
三、乳酸菌胞外多糖的纯化1. 纯化方法本部分主要介绍采用高效液相色谱法（HPLC）和超滤法对EPS进行纯化的方法。
HPLC法可有效分离不同分子量的EPS组分，超滤法则可去除EPS中的杂质和低分子量组分。
2. 纯化效果评价通过对比纯化前后EPS的物理化学性质、分子量分布、结构特点等，评价纯化效果。
同时，采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）对纯化后的EPS进行结构分析。
四、乳酸菌胞外多糖的免疫活性研究1. 动物实验采用动物实验研究EPS的免疫活性。
将EPS以适当剂量喂食实验动物，观察其对动物免疫系统的影响，如对免疫器官发育、免疫细胞数量和功能的影响等。
2. 细胞实验通过细胞实验研究EPS对免疫细胞的刺激作用及信号传导机制。
采用流式细胞术、荧光定量PCR等技术检测EPS对免疫细胞表面标志物、细胞因子分泌等的影响。
3. 结果分析根据实验结果，分析EPS的免疫活性及其作用机制。
同时，结合文献报道的其他乳酸菌EPS的免疫活性研究结果，进行综合分析。
乳酸菌胞外多糖的分离筛选方法研究进展
１引言
２产胞外多糖乳酸菌的筛选方法 ２ ． １ ＭＲｓ 一 溴 甲酚 紫平 板 筛选 法 乳酸 菌 ， 是 一类无芽孢 、 革兰 氏染 色为 阳性 的异养
厌 氧型原 核细菌 ， 能够 发酵糖类 ， 产物 主要为乳 酸（ 辨 别的主要 标志） ， 其形态 多样主要 以链状 和杆状 存在 。 乳 酸菌对 人体有 诸多 益处 ， 比如乳 酸菌在生 长过程 中 消耗乳 酸对 预 防和治疗 乳糖 不耐症有 良好 的作用 ； 同 时发 酵 的产 物可 以促 进钙 、 镁离 子 及蛋 白质 、 单糖 等 营 养物质 的 吸收 ； 还可 以产生 Ｂ族维 生素 等大 量有 益 物质； 另外 ， 乳酸菌 的生 长可 以增加 肠道 的益生菌群 ， 进 一步 改善人体 胃肠道 功能 ， 保持人 体肠道 内菌群 平 衡， 维护人 体健康 ； 也可 以抑 制腐败菌 的繁殖 ； 同时消 解腐败 菌产生的毒素 ， 清 除肠道垃圾 ； 代谢产物还 可以 抑 制胆 固醇吸 收 ， 有降血 脂 、 降 血压作 用 ； 亦可 以提高 Ｓ ＯＤ酶活力 ， 消除人 体 自由基 ， 具有 抗衰老 、 延年益 寿 作用。 此外， 还 有一 些报 道认 为 乳酸 菌能有 效 的预 防 女 性泌尿 生殖系统 细 菌感 染 ， 还能控 制人体 内毒素水 平， 保护 肝脏 并有 助于增 强肝 脏的解 毒 、 排 毒功能 。 总 之， 乳 酸菌现在 是备 受瞩 目， 前景广 阔 。 胞外多糖（ ｅ ｘ ｏ ｌ ｍｌ ｙ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ ， Ｅ Ｐ Ｓ ） 是 由细菌及少数 酵母 菌和 丝状真 菌在生 长 的过程 中产生 的 。 微 生物产 生 的Ｅ Ｐ Ｓ 可 以在 自然环境 中起 到保护微生 物细胞的作 用， 比如 使 细胞避 免 因干 燥而 引起 脱水 、 防止 被噬 菌 体侵 染 ， 同时还 可维持 细 胞 的渗 透压 ， 并且 参 与到细 胞 的信息 传递和 细胞 的构成 等作用 。 自从通过 肠膜 明 串珠菌肠 膜亚种（ Ｌ ｅ ｕ ｃ ｏ ｎ ｏ ｓ ｔ ｃ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｉ ｄ ｅ ｓ ｓ ｕ ｂ ｓ ｐ ． ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｉ ｄ ｅ ｓ ） 的发酵生 产 出右旋糖酐 以来 ， 乳酸菌胞 外多糖 的 开发与 应用便 引起 了诸多研 究人 员 的关注 ， 已变成 了一个 重大 的研究 热点［ 】 ｌ 。 乳 酸菌Ｅ Ｐ Ｓ 是乳 杆菌诸多 菌属 中多种乳 酸细菌在 特 定 环 境 下 分 泌 到 细 胞 壁 外 的 黏 液 或 荚 膜 多 糖 （ ｃ ａ ｐ ｓ ｕ ｌ ａ ｒ ｐ ｏ ｌ ｙ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ ） 。 乳酸菌Ｅ Ｐ Ｓ 的作用很多 ， 在酸 乳形成方面 ， 对其质构与 风味 ， 产 生特有的营养价值方 面有极为重要 的作用 与影响 ， 它可 以增加酸奶 的黏度 ， 提高酸奶稳定性 和保 水性 ， 使产 品具有 良好 的 口感 、 质 地和风味 。 又因为乳酸菌Ｅ Ｐ Ｓ 具有安全无 毒的特性 ， 所 以在食 品工 业 中作 为增稠 剂 、 稳定剂 、 乳化剂 、 胶 凝剂 及保湿剂 而被广 泛的应用 。 通过研 究 ， 部分乳酸 菌Ｅ Ｐ Ｓ 还具有抗肿瘤 、 抗病 毒 、 抗衰老 、 降低血糖 、 增 强人体免 疫力 、 调 节 胃肠功 能 、 降血 清胆 固醇 等多种生 理功 能 ， 因此将 其开发为 功能性 食 品具有 广 阔的推广 前景 。 本文综合 阐述拉近几 年有 关乳酸 菌Ｅ ＰＳ 分 离纯化 实验 的研 究报道 ， 总结 分析一 些分离 纯化 的手段并说
内蒙古奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选
内蒙古奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选1.3乳酸菌分离方法取少量样品接入11%脱脂乳(m/V)中，37℃培养，凝乳后取样逐级稀释，选3个适宜的稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布于MRS琼脂平板[7]，37℃培养48h。
选取合适的平板，挑取典型菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，其中革兰氏染色阳性和过氧化氢酶实验阴性的菌株初步鉴定为乳酸菌，继续划线培养分离纯化，直至得到纯菌，纯化后的菌株接种到MRS液体培养基培养后，加入20%甘油，－80℃冰箱保存备用。
1.4乳酸菌属的鉴定根据凌代文等[8]和杨洁彬等[9]介绍，乳杆菌属的生化特征是形态为单个、成对或链状排列的短或长杆菌，通常不运动，革兰氏染色阳性，微好氧。
极少见硝酸盐还原反应，不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和H2S，过氧化氢酶阴性，无细胞色素，联苯胺反应阴性。
最适生长温度是30～40℃，耐酸，最适pH值通常为5.5～6.2。
乳杆菌种的划分主要依据碳水化合物发酵实验。
1.5 API鉴定乳酸杆菌的碳水化合物发酵曲线采用API50CH试条测定，按Snart[10]的方法操作，稍有改动。
乳酸菌于MRS琼脂平板上37℃厌氧培养2d，用无菌牙签挑起部分菌落加入悬液基物(2mL无菌生理盐水)的试管中，制成浓的菌悬液(S)；打开悬液基物(5mL无菌生理盐水)的试管，加入少量上述浓菌(S)制得相当于2 McFarland浊度(OD 600nm≈0.3 5)的菌悬液，记录体积(V)；打开API50CHL培养基的安瓿，加2倍(2V)该菌液接种。
用已接种的API50CHL 培养基加入反应管中，并用灭菌的液体石蜡油覆盖所有的测定管，于37℃厌氧培养48h后读取结果。
发酵结果提交到生物梅里埃公司(北京)，根据API数据库现存的数据判定实验结果。
1.6乳酸菌荚膜显微镜观察M R S培养液中生长的新鲜菌体，采用墨汁负染法，于Olympus BX51显微镜油镜下观察，DP71照相。
产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选
产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的分离、筛选1.目的要求(1)熟悉产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选方法(2)了解乳酸菌产胞外多糖的基本原理2.基本原理微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的荚膜多糖或黏液多糖，属于微生物的次级代谢产物。
微生物EPS是一种长链、高分子质量的聚合物，甚独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业备受青睐，尤其是它在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。
自然界中能产生多糖的微生物种类很多，涉及细菌、酵母和丝状真菌。
长久以来，乳酸菌用于发酵乳的生产，通常认为乳酸菌EPS安全性更为可靠，而且乳酸菌作为生理功能调节剂，利用益生菌制成活菌制剂，省去常规发酵、提取等繁琐工艺。
因此，开发乳酸菌EPS较其他微生物EPS来说，更具有理论意义与实际价值。
多糖难溶于乙醇，因此如果乙醇溶液中有絮状沉淀出现，通常可认为样品中含有多糖。
本实验就是利用多糖的这种性质来沉淀分离微生物EPS以供下一步的多糖检测。
目前用于多糖检测的方法较多，主要有干燥称重法、硫酸一蒽酮法、DNS(3, 5一二硝基水杨酸）法、苯酚一硫酸法、相对黏度法和Imshenetskii等报道的浊度法等。
由于苯酚一硫酸法具有简单方便、显色稳定、灵敏度高、重现性好、不受蛋白质干扰等优点而深受欢迎。
其原理是根据苯酚一硫酸试剂与游离的寡糖和多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）发生的显色反应。
己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
具体操作见实验步骤。
本实验利用多糖难溶于乙醇的性质来沉淀分离微生物EPS。
本实验以乳制品和肉制品为初始原料，分离产EPS的乳酸菌菌株并筛选高产EPS的优良菌株。
3实验材料3.1原料从市场上购买的乳制品、肉制品。
3.2培养基MRS液体培养基、固体培养基（1.5％琼脂）。
高产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的筛选与鉴定
高产胞外多糖(EPS)乳酸菌菌株的筛选与鉴定
潘道东;吴玲
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2007(028)003
【摘要】本研究对收集的3个混合发酵剂进行了分离、筛选,并通过测定其pH值、粘度和EPS产量,从中筛选出了两株高产EPS的乳酸菌.利用API细菌鉴定系统对
这两株高产EPS乳酸菌的属性进行了鉴定,分别为乳酸乳球菌乳亚种和片球菌.
【总页数】4页(P171-174)
【作者】潘道东;吴玲
【作者单位】南京师范大学金陵女子学院食品科学系,江苏,南京,210097;南京师范
大学金陵女子学院食品科学系,江苏,南京,210097
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
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根据未知菌株的生化谱，用鉴定软件包鉴 定菌株。 1.3.6 菌种的保存
将已分离的高产 EPS 乳酸菌液体培养物 在－70℃、真空度≤12Pa 条件下真空冷冻干燥， 将冻干的菌种保存于-70℃超低温冰箱中。
表 4 几种已知乳酸菌的 EPS 产量
菌种名
EPS 合成量（mg/L）
瑞士乳杆菌 1004 （Lactobacillus helveticus ATCC1004） 瑞士乳杆菌 15019 （Lactobacillus helveticus ATCC15019） 德氏乳杆菌保加利亚亚种 13953
263.22 213.33 427.71
多糖是指由 20 个以上单糖组成的糖类化 合物，根据来源不同，可分为植物、动物和微 生物多糖。自 20 世纪 40 年代成功开发出由肠 明串珠菌发酵产生右旋糖酐以来，新的微生物 胞外多糖的研究与开发在世界范围内已成为 研究的热点［2］，其中又以乳杆菌属、链球菌属、 明串珠菌属、乳球菌属等乳酸菌的胞外多糖研 究较多。
摘 要：本文首先从高产 EPS 混合乳酸菌中分离纯化了 12 种乳酸菌，测定不同菌 种在 40℃下液体培养 12h 后菌液的 OD 值、活菌数；然后将 12 种菌在适宜条件下分别 制成酸奶并测定其 pH 值、粘度和产胞外多糖量，从中筛选出了两株产多糖量最高的乳 酸菌种；最后利用 API 细菌鉴定系统对这两种乳酸菌进行鉴定，分别为乳酸乳球菌乳 亚种 1 和片球菌属。
2 结果与讨论
2.1 高产 EPS 混合乳酸菌的分离纯化 本实验共分离了 12 种乳酸菌，通过镜检
保证每种被分离乳酸菌的形态是一致的，主要 为杆状和球形两种，其革兰氏染色结果见表 1。
菌种 1 2 代号 染 色 G＋ G— 结果
表 1 分离的未知乳酸菌的革兰氏染色结果
3
456
7 8 9 10 11 12
菌种 序号 1
指标 OD600 0.132
菌落数(×108cfu/mL) 3.72
菌种 序号 7
指标 OD600
0.419
菌落数(×108cfu/mL) 11.67
2
0.298
6.51
8
0.191 4.25
3
0.062
2.04
9
0.195 4.50
4
0.121
3.68
10
0.497 12.12
5
0.372
将制备好的酸奶用饱和 NaOH 调 pH 至 8.0，4000r/min 离心 15min，取上清液；将上 清液用 HCl 调节至 4.6，4000r/min 离心 15min， 取上清液[8]。用 NaOH 将上清液调至 7.5，加 入 1/10 体积的胰蛋白酶液（浓度为 3g/L，现 配现用），40℃水浴酶解 2.5h。加入 1/3 体积 Sevag 液，振摇 30min 后，4000r/min 离心 15min，去除沉淀，重复一次。加入 3~5 倍体 积的 95%的乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀 析出），4000r/min 离心 15min，得沉淀。将沉 淀用丙酮洗涤脱水两次，真空冷冻干燥得白色 粉末为多糖（通过此种方法得到的为粗多糖） [9]。 1.3.4.2 EPS 含量的测定
脱脂乳粉，上海光明乳业股份有限公司， 市售；Sevag 液[7]（氯仿:正丁醇(v/v)=3：1）。 1.2 主要仪器设备
电子显微镜（OLYMPUS OPTICAL CO. LTD），NDJ-8S 粘度计（上海第三分析仪器厂）， PHS-3C 型精密 pH 计（上海雷磁分析仪器厂）， 722 可见光分光光度计（上海精密科学仪器有 限公司），MCFD-5505A 真空冷冻干燥机（上 海虹益仪器仪表有限公司） 1.3 实验方法 1.3.1 酸奶中乳酸菌的分离纯化
×100% 其中：c 为苯酚—浓硫酸法所测吸光度由
回归直线方程求得的浓度（µg/mL）；w 为待测 样品的质量（g）。 1.3.5 高产 EPS 乳酸菌种的鉴定
利用 API 细菌鉴定系统对未知的高产 EPS 乳酸菌进行鉴定。API 50 CHL 是用于乳酸杆 菌（Lactobacillus）和相关菌的鉴定，它是由 49 种可发酵碳水化合物的 API 50 CHL 试验条 组成的简易培养基。以测定菌制成悬液接种试 验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水 化合物产酸，pH 下降，使指示剂变色。结果 构成菌株的生化图谱，并用于鉴定或分型。 1.3.5.1 选取菌落和接种物的制备
10%(w /v) 的 脱 脂 乳 在 90℃ 下 杀 菌 15min，杀菌结束后冷却至 37℃，无菌操作条 件下，按 5%（v/v）的接种量分别接种活化好 的 12 种乳酸菌，在 43℃发酵至凝乳，4℃后熟 12h 以上备用。分别用 pH 计和粘度仪测定酸 奶的 pH 值和粘度。 1.3.4 EPS 的提取和含量测定 1.3.4.1 EPS 的提取
(Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC13953) 嗜热链球菌 13957 （Streptococcus thermophilus ATCC13957）
2008 年第 1 期 总第五十五期
常州工程职业技术学院学报
JOURNAL OF CHANGZHOU INSTITUTE OF ENGINEERING TECHNOLOGY
Vol.1 2008 April No.55
高产胞外多糖的乳酸菌菌种的筛选
吴玲 何颖
（常州工程职业技术学院 应用化学技术系， 江苏 常州 213164）
G—
G＋ G＋ G—
G＋ G＋ G＋ G＋
G＋
G—
2.2 乳酸菌菌液吸光度及菌落数
培养条件下，10 号菌的菌液密度和活菌数是最
活化的乳酸菌经过 12h 的培养，菌液吸光 大的，7 号菌次之，再次是 5 号菌
度及菌落数如表 2。由表可以看出，在相同的
72
高产胞外多糖的乳酸菌菌种的筛选
表 2 未知乳酸菌培养 12h 后菌液吸光度及菌落数
菌保加利亚亚种（13953）、嗜热链球菌（13957） 及高产 EPS 混合乳酸菌，均由南京师范大学食 品系乳肉科学实验室提供。 1.1.2 培养基
MRS 培养基：用于分离纯化菌种；脱脂 乳培养基：10%(w/v)的脱脂乳，用于凝乳及发 酵实验； API 50 CHL 培养基：用于乳酸菌菌 种鉴定。 1.1.3 其他材料
关键词：胞外多糖；料， 并能产生大量乳酸的细菌的通称。按伯杰氏系 统细菌学手册中的生化及形态分类法，乳酸菌 分为 18 个属。而在食品、医药等领域应用较 多的乳酸菌主要有 7 个属，分别为乳杆菌属、 链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属、 明串珠菌属和双歧杆菌属［1］。
乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌发酵产生的， 分泌在细胞外的，常渗入到培养基中的糖类化 合物。根据其所在的位置，可分为荚膜多糖和 粘液多糖。乳酸菌胞外多糖的生物合成因菌种 的不同而发生在不同的条件下，按合成位点和 合成模式不同，其胞外多糖的合成可分为 2 类，
即细胞壁外的同源多糖的合成与细胞膜上的 异源多糖的合成［3］。Wigandi 等［4］认为乳酸菌 合成 EPS 可能有 3 种方式：(1)加速扩散；(2) 活性传递；(3)基因转移。
许多乳酸菌是历史悠久的工业生产菌，乳 酸菌胞外多糖不仅对乳制品的结构和风味具 有重要影响，而且有可能成为食品级多糖的一 个极好的来源而广泛应用于各种食品的增稠、 稳定、乳化、胶凝及保湿［5］；而且，近十多年 来的研究发现［6］，活性多糖除了具有抗病毒、 抗衰老、降血糖、刺激造血等作用外，还有抗 肿瘤、抗溃疡、免疫调节、调节胃肠功能、降 低胆固醇等生物学功效。其中，来源于乳酸菌 的胞外多糖由于对机体无毒副作用，来源安全 可靠等优点，逐渐被人们所关注。因此，将乳 酸菌胞外多糖作为功能性食品的成分进行开 发和研究具有很大潜力。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌种
瑞士乳杆菌（1004 和 15019）、德氏乳杆
收稿日期：2007-12-21 作者简介：吴玲（1981-），女，江苏常州人，常州工程职业技术学院教师，微生物学硕士；何颖（1981— ），女，
江苏南通人，常州工程职业技术学院教师，遗传学硕士。
70
高产胞外多糖的乳酸菌菌种的筛选
将本实验室收藏的高产 EPS 混合乳酸菌 种接种到 MRS 液体培养基中，37℃静置培养 至培养基混浊后转接 1 次活化，然后转接到 pH5.8~6.0 的 MRS 液体培养基中复筛，培养条 件同上，转接 3 次后用无菌生理盐水稀释到适 宜浓度涂 MRS 平板，倒置于 40℃恒温培养箱 48h 后，挑取平板上不同形态的单菌落，转接 到 MRS 斜面上。待菌落长出后，仔细观察斜 面菌苔的颜色、光泽、透明度等是否一致，并 取少许培养物涂片，革兰氏染色后镜检，观察 菌体形态，进行初步分类。将纯化的未知菌种 斜面保存于 4℃冰箱。 1.3.2 菌液吸光值的测定及活菌计数
吸光值的测定：将纯化的乳酸菌接种于 MRS 液体培养基中，40℃静置培养 12h 后转 接 3 次活化。将活化的 12 种乳酸菌转接至 MRS 液体培养基中，40℃恒温培养 12h 后，将菌液
混匀并在 600nm 处测定吸光度。 活菌计数：采用平板倾注法进行活菌计
数。将培养 12h 后的菌液用无菌生理盐水逐级 稀释，选取 3 个适宜浓度梯度，每个梯度设 3 个平行，40℃培养 48h 后进行活菌计数。 1.3.3 酸奶的制作及其 pH 值和粘度的测定
EPS 含量的测定主要采用苯酚—浓硫酸 法，用葡萄糖作标准曲线［10，11］。
（1）葡萄糖标准曲线的制备 首先配制浓度为 250µg/mL 标准葡萄糖溶 液，精确量取葡萄糖标准溶液 3mL、4mL、 5mL、6mL、7mL、8mL 至容量瓶中，加水定 容至 500mL，精确吸取 1.0mL 各标准溶液， 再分别加入 5%苯酚（置棕色瓶，4℃保存）溶 液 0.6mL，摇匀后静置 2min，迅速加入浓硫酸