酶定向进化

• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶
分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改
造或构建新的非天然酶.
定向进化
• 定向进化是模拟自然进化的过程，进
行人工随机突变，并在特定的环境条件下
进行选择，使进化朝着人们所需要的方向
发展的技术过程。
• 分为分子定向进化和细胞定向进化
细胞定向进化
外进行人工随机突变，然后进行定向选择
而获得所需突变体。
酶分子定向进化
• 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程
（随机突变和自然选择），在体外进行酶
基因的人工随机突变，建立突变基因文库，
在人工控制条件的特殊环境下，定向选择
具有优良催化特征的酶的突变体的技术过
程。
酶定向进化的基本过程
酶基因
随机突变 反复进行
交错延伸PCR技术特点
• 省去了用DNA酶切割成片段这一步，简化
了DNA重排方法。 • 交错延伸法重组发生在单一试管中，不需 分离亲本DNA和产生的重组DNA。
• 2）随机引物体外重组技术 • 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模 板不同部分的序列互补DNA小片断，然后 除去模板，这些DNA小片断互为模板和引 物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而 获得全长突变基因。
第八章 酶定向进化
（一）教学目的与要求：
1、掌握：酶定向进化的特点。
2、熟悉：酶基因的随机突变。 3、了解：酶突变基因的定向选择。 （二）教学重点：易错PCR技术、ＤＮＡ重排技术、 交错延伸PCR技术、随机引物体外重组技术、基因 家族重排技术概念及特点。 难点：酶基因的随机突变。 （三）课时安排：2课时 （四）教学方法：讲授法；多媒体教学
• 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变 基因文库中分离得到同源DNA，用酶切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
来自百度文库
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变基因
基因重组
构建突变基因文库 负突变基因
• 这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA 随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序 列经过重新排布而形成众多的突变基因。
特点
• DNA重排技术将两条或多条正突变基因结合在一
起，通过碱基重排形成新的突变基因，为有性进化 • 正突变率高，进化速度较快。（DNA重排技术是 在原有正突变的基础上进行） • 操作过程要去除DNase Ⅰ，使操作复杂化。
构建突变基因文库 筛选 正突变基因 进化酶
负突变基因
第一节 酶基因的随机突变
1、 易错PCR技术
2、ＤＮＡ重排技术
3、基因家族重排技术
• 基因随机突变方法的特点P207表8－1
• 随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选， 以完成对酶的定向进化。
一 、易错PCR技术
• 从酶的单一基因出发，在改变反应条 件的情况下进行聚合酶链式反应（PCR）， 使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从 而引起基因突变的技术过程。 可以通过提高镁离子浓度、添加一定 浓度的锰离子、改变4种底物（dATP、 dTTP、dCTP、dGTP）的浓度比等反应条 件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增 加碱基配对错误的出现频率。
（反复进行）
筛选
正突变基因
进化酶
• DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧 核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ)等酶的作用，随机切割 成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引 物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机 片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适 宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无引物PCR 突变基因 基因重组 突变基因文库 负突变基因 筛选 反复进行 正突变基因 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基 因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
• 1）交错延伸PCR技术：
•
在同一个反应体系中以两个或多个相关的 DNA片断为模板进行PCR反应，把PCR反应中常 规的退火和延伸合并为一步，缩短反应时间，从 而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链 再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而 继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基 因长度。
第二节 酶突变基因的定向选择
• 突变基因的定向选择基本过程
突变基因 基因载体
基因重组 突变基因文库
筛选 目的基因
一 、酶突变基因文库的构建
• （一）构建基因文库的质量要求
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰富。
• 正突变的概率低，突变基因文库较大，文
库筛选的工作量大，一般适用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
二、 DNA重排技术
• 由美国Stemmer 于1994 年首次提出一项 体外重组技术