植物组培污染
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二、实验人员的污染
• 7.打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘； • 8.接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污 染了材料； • 9.没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中； • 10.中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿 入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿； • 11.服装、帽子、口罩、拖鞋长期穿戴后较脏，表面有大量灰尘，未经 清洗反复穿戴后造成污染。
• 5.封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导 致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；
三、培养基的污染ห้องสมุดไป่ตู้
• 6.橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入 培养容器；
• 7.灭菌方法不当导致培养基污染；
• 8.灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；
• 9.灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部 杂菌有可能被倒吸入容器中；
2.材料的表面消毒
• 外植体在接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不 同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸 馏水冲洗掉或能自行分解的物质，而且不会损伤或轻微损伤组织材料，而不 影响生长。植物种类不同，外植体不同，处理也不同。 • 为了获取无菌材料，对室外采集来的外植体，先用自来水冲洗干净，然后 根据材料的不同，选用不同种类的灭菌剂，进行不同时间的表面灭菌。 • 选择适宜的消毒剂处理时，为了使其消毒效果更为彻底，有时还需与黏着剂 或润湿剂如吐温及抽气减压方法、磁力搅拌、超生振动等方法配合使用，使 消毒剂能更好地渗入外植体内部，达到理想的消毒效果。如在芳香植物唇萼 薄荷组织培养中，由于腋芽密生绒毛且部位通常较隐蔽，似很难与消毒液彻 底接触，致使消毒效果不理想，于是在饱和漂白粉溶液中加入0．1％Tween －80混合均匀，并采用软毛刷轻轻刷洗材料，尤其是腋芽部位，这样可以使 消毒液与材料充分接触，使消毒效果明显提高。
• 10.过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入 培养基后造成污染。
防治措施
分装后的培养基封口后应尽快进行高温高压灭菌。灭菌不 及时，会造成杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。为了保证培 养基灭菌彻底，降低污染，在灭菌过程中需注意以下几个环节： （1）灭菌加热过程中应使灭菌锅内的冷空气放尽，以保证灭 菌彻底； （2）锅内灭菌物不能堆放过满，否则，将阻碍蒸汽的流通和 热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全； （3）灭菌后，应切断电源，使灭菌锅内的压力缓慢降下来， 接近“0”时，才可打开放气阀，排出剩余蒸汽后，打开锅盖 取出培养基。 注意：千万别急于取出培养基而打开放气阀，这样会造成降压 过快，使容器内外压差过大，液体溢出，造成浪费、污染，甚 至危机人身安全。
三、培养基的污染
• 1.在培养基配置的过程中，会加入糖、水、无机盐、维生素、植物生 长调节物质等物质。使用长菌的母液配制培养基；
• 2.培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；
• 3.培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；
• 4.培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器 使培养基污染；
防治措施
• 可以采取在培养基中加入抗生素和杀 菌剂的方法抑菌或杀菌。
植物组培中易被污染，为了避免各种污 染，我们应尽量操作规范，同时应预测 过程中可能会出现的微生物污染，提前 防治，以便后期能达到培养目的。
五、接种过程中的污染
• 在外植体接种的过程中，接种人员没有在无菌条件下进行操作，
接种过程中没有使用无菌器械，没有在酒精灯下进行，都会使外
植体受到污染。
防治措施
• 在接种中，为了降低污染，应注意以下几项事宜： • 接种室保持干净整洁，应定期对接种室进行喷雾降尘和熏蒸灭菌，并在每次 接种前对接种室进行20～30 min的紫外灭菌。 • 接种过程中操作人员应及时用75％酒精擦拭双手和超净工作台台面。接种器 械应及时在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，或在接种器械杀菌器中及时灭菌。 • 尽量少说话或咳嗽，避免呼吸污染。 • 超净工作台上应保持气流畅通，使操作区空气不断净化。当打开培养瓶接种 时，培养瓶应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。
二、实验人员的污染
1.过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接 种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩 2.不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污 染 3.超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭 菌效果差 4.接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌； 5.操作时手超出工作台面； 6.手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生 物落入培养容器中；
2.材料的表面消毒
• 此外，如果在继代培养中发现污染，我们可 以采用抗生素(如青霉素、氮苄青霉素等)和 杀菌剂(如多菌灵、代森锌等)处理结合常规 消毒，重新得到无菌苗。 • 再者，在一些快繁体系连续多次继代后， 部分试管苗插入培养基的切口处会出现云雾 状污染苗。对于这种污染，我们也可以采取 在继代培养基中加入适量抗生素(如青霉素、 氨苄青霉素、四环素等)来替代抑菌。但是随 着继代次数的增多，抗生素对污染苗的抑菌 作用可能会降低，一方面是由于抗生素的消 耗，另一方面可能是由于菌类对抗生素产生 了耐药性。
了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。
四、外植体的污染
• ③灭菌效果。外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定 了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差， 使外植体带菌。 • 如消毒剂消毒效果不够，或者灭菌时间太短，使得微生物没有被 完全杀死。另外消毒步骤不正确，不能达到最佳的灭菌效果，也 可能导致细菌或真菌残留。
植物组培过程中的 污染及预防措施
PPT制作：李郑慧、杨文娇 PPT演示：劳梦
组培过程中的污染
• 一、实验器皿和无菌操作室 • 二、实验人员的污染 • 三、培养基的污染
• 四、外植体的污染
• 五、接种过程中的污染
• 六、继代培养产生的污染
一、实验器皿和无菌操作室
• 接种室和培养室： • 1.人员的进出导致接种室和培养室空气中存在大量细菌和真菌， 尤其是接种过程中非工作人员的进出； • 2.接种室设计不合理，造成室内灰尘、细菌过多； • 3.超净工作台置于灰尘太多的地方，过滤装置使用过久、保养不 当造成失效； • 4.组培室、接种室门窗封闭不严，苍蝇等趁机飞入，利于杂菌传 播； • 5.培养室面积大易污染，室内温度高、空气湿度大，菌类繁殖旺 盛也会加重污染。
防治措施
1. 外植体的采集 2. 材料的表面消毒
1.外植体的采集
• 为了防止材料带菌，我们在采集 外植体时，应注意以下几点：在 生长健壮的无病虫害的植株上选 取发育正常的组织或器官；或将 嫩梢采集回来，放在洁净的空气 中水培抽芽，然后 • 用这种新生组织培养，也可以避 免污染。在晴天中午采集外植体。 采集易于消毒和灭菌的组织部位 进行培养，也可以降低污染率。
四、外植体的污染
• ①年龄、种类和大小。成年植株带菌多；生理年龄老的材料带 菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染； 室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌 多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多。
• ②取材时期和部位。雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳
光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取
防治措施
1. 在进入实验室内，必须穿指定拖鞋； 2. 员工进入实验室时，将自己的鞋放入鞋柜，换上指定实验室拖鞋方可进入实 验室内上岗。 3. 员工上班不能着艳装，不能穿挂带式衣服，不能穿短裤、裙子上班，上班不 能裸脚。 4. 全体员工在进入实验室前应自觉做好自检是否携带禁品（如：与无作无关的 东西或食品 等），并按规范穿好防静电衣、裤、鞋、帽后方可进入生产实 验室内 。 5. 每天上班操作前必须确认有按作业指导书要求或本规范做好防尘措施，有戴 手套或指套。 检查周期：每天2次上午下午各1次。 6. 除操作员外，相关人员要进实验室必须经过主管审批后，方可进入实验室；
二、实验人员的污染
• 7.打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘； • 8.接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污 染了材料； • 9.没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中； • 10.中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿 入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿； • 11.服装、帽子、口罩、拖鞋长期穿戴后较脏，表面有大量灰尘，未经 清洗反复穿戴后造成污染。
• 5.封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导 致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；
三、培养基的污染ห้องสมุดไป่ตู้
• 6.橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入 培养容器；
• 7.灭菌方法不当导致培养基污染；
• 8.灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；
• 9.灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部 杂菌有可能被倒吸入容器中；
2.材料的表面消毒
• 外植体在接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不 同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸 馏水冲洗掉或能自行分解的物质，而且不会损伤或轻微损伤组织材料，而不 影响生长。植物种类不同，外植体不同，处理也不同。 • 为了获取无菌材料，对室外采集来的外植体，先用自来水冲洗干净，然后 根据材料的不同，选用不同种类的灭菌剂，进行不同时间的表面灭菌。 • 选择适宜的消毒剂处理时，为了使其消毒效果更为彻底，有时还需与黏着剂 或润湿剂如吐温及抽气减压方法、磁力搅拌、超生振动等方法配合使用，使 消毒剂能更好地渗入外植体内部，达到理想的消毒效果。如在芳香植物唇萼 薄荷组织培养中，由于腋芽密生绒毛且部位通常较隐蔽，似很难与消毒液彻 底接触，致使消毒效果不理想，于是在饱和漂白粉溶液中加入0．1％Tween －80混合均匀，并采用软毛刷轻轻刷洗材料，尤其是腋芽部位，这样可以使 消毒液与材料充分接触，使消毒效果明显提高。
• 10.过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入 培养基后造成污染。
防治措施
分装后的培养基封口后应尽快进行高温高压灭菌。灭菌不 及时，会造成杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。为了保证培 养基灭菌彻底，降低污染，在灭菌过程中需注意以下几个环节： （1）灭菌加热过程中应使灭菌锅内的冷空气放尽，以保证灭 菌彻底； （2）锅内灭菌物不能堆放过满，否则，将阻碍蒸汽的流通和 热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全； （3）灭菌后，应切断电源，使灭菌锅内的压力缓慢降下来， 接近“0”时，才可打开放气阀，排出剩余蒸汽后，打开锅盖 取出培养基。 注意：千万别急于取出培养基而打开放气阀，这样会造成降压 过快，使容器内外压差过大，液体溢出，造成浪费、污染，甚 至危机人身安全。
三、培养基的污染
• 1.在培养基配置的过程中，会加入糖、水、无机盐、维生素、植物生 长调节物质等物质。使用长菌的母液配制培养基；
• 2.培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；
• 3.培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；
• 4.培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器 使培养基污染；
防治措施
• 可以采取在培养基中加入抗生素和杀 菌剂的方法抑菌或杀菌。
植物组培中易被污染，为了避免各种污 染，我们应尽量操作规范，同时应预测 过程中可能会出现的微生物污染，提前 防治，以便后期能达到培养目的。
五、接种过程中的污染
• 在外植体接种的过程中，接种人员没有在无菌条件下进行操作，
接种过程中没有使用无菌器械，没有在酒精灯下进行，都会使外
植体受到污染。
防治措施
• 在接种中，为了降低污染，应注意以下几项事宜： • 接种室保持干净整洁，应定期对接种室进行喷雾降尘和熏蒸灭菌，并在每次 接种前对接种室进行20～30 min的紫外灭菌。 • 接种过程中操作人员应及时用75％酒精擦拭双手和超净工作台台面。接种器 械应及时在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，或在接种器械杀菌器中及时灭菌。 • 尽量少说话或咳嗽，避免呼吸污染。 • 超净工作台上应保持气流畅通，使操作区空气不断净化。当打开培养瓶接种 时，培养瓶应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。
二、实验人员的污染
1.过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接 种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩 2.不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污 染 3.超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭 菌效果差 4.接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌； 5.操作时手超出工作台面； 6.手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生 物落入培养容器中；
2.材料的表面消毒
• 此外，如果在继代培养中发现污染，我们可 以采用抗生素(如青霉素、氮苄青霉素等)和 杀菌剂(如多菌灵、代森锌等)处理结合常规 消毒，重新得到无菌苗。 • 再者，在一些快繁体系连续多次继代后， 部分试管苗插入培养基的切口处会出现云雾 状污染苗。对于这种污染，我们也可以采取 在继代培养基中加入适量抗生素(如青霉素、 氨苄青霉素、四环素等)来替代抑菌。但是随 着继代次数的增多，抗生素对污染苗的抑菌 作用可能会降低，一方面是由于抗生素的消 耗，另一方面可能是由于菌类对抗生素产生 了耐药性。
了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。
四、外植体的污染
• ③灭菌效果。外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定 了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差， 使外植体带菌。 • 如消毒剂消毒效果不够，或者灭菌时间太短，使得微生物没有被 完全杀死。另外消毒步骤不正确，不能达到最佳的灭菌效果，也 可能导致细菌或真菌残留。
植物组培过程中的 污染及预防措施
PPT制作：李郑慧、杨文娇 PPT演示：劳梦
组培过程中的污染
• 一、实验器皿和无菌操作室 • 二、实验人员的污染 • 三、培养基的污染
• 四、外植体的污染
• 五、接种过程中的污染
• 六、继代培养产生的污染
一、实验器皿和无菌操作室
• 接种室和培养室： • 1.人员的进出导致接种室和培养室空气中存在大量细菌和真菌， 尤其是接种过程中非工作人员的进出； • 2.接种室设计不合理，造成室内灰尘、细菌过多； • 3.超净工作台置于灰尘太多的地方，过滤装置使用过久、保养不 当造成失效； • 4.组培室、接种室门窗封闭不严，苍蝇等趁机飞入，利于杂菌传 播； • 5.培养室面积大易污染，室内温度高、空气湿度大，菌类繁殖旺 盛也会加重污染。
防治措施
1. 外植体的采集 2. 材料的表面消毒
1.外植体的采集
• 为了防止材料带菌，我们在采集 外植体时，应注意以下几点：在 生长健壮的无病虫害的植株上选 取发育正常的组织或器官；或将 嫩梢采集回来，放在洁净的空气 中水培抽芽，然后 • 用这种新生组织培养，也可以避 免污染。在晴天中午采集外植体。 采集易于消毒和灭菌的组织部位 进行培养，也可以降低污染率。
四、外植体的污染
• ①年龄、种类和大小。成年植株带菌多；生理年龄老的材料带 菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染； 室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌 多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多。
• ②取材时期和部位。雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳
光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取
防治措施
1. 在进入实验室内，必须穿指定拖鞋； 2. 员工进入实验室时，将自己的鞋放入鞋柜，换上指定实验室拖鞋方可进入实 验室内上岗。 3. 员工上班不能着艳装，不能穿挂带式衣服，不能穿短裤、裙子上班，上班不 能裸脚。 4. 全体员工在进入实验室前应自觉做好自检是否携带禁品（如：与无作无关的 东西或食品 等），并按规范穿好防静电衣、裤、鞋、帽后方可进入生产实 验室内 。 5. 每天上班操作前必须确认有按作业指导书要求或本规范做好防尘措施，有戴 手套或指套。 检查周期：每天2次上午下午各1次。 6. 除操作员外，相关人员要进实验室必须经过主管审批后，方可进入实验室；