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染液，倒去玻片上水。 2、加碘液染1min，水洗。 3、加脱色液（95%乙醇），不使摇动10-30s，至无紫
色脱落为止，水洗。 4、加复染液（碱性复红液），染30s，水洗。 5、干后镜检。
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革兰染色法
❖ 三、注意事项： 1、涂片：菌液涂片时，用接种环蘸取菌液直接在玻片
上涂布；若是菌落，先取生理盐水1滴，置于玻片上，用 接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
2、干燥：制备的涂片应自然干燥。 3、固定：多采用加热固定，目的在于保持细胞原有的 形态和结构，杀死细菌，使染料易于着色，并是细菌附着 于玻片上不易脱落。自然冷却后在染色。 4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性 菌。因此必须严格把握脱色时间。
2、染色的时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细 胞数量成正比。
3、冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉 淀在血膜上。
4、如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需 立即用水冲掉甲醇，以免脱色。
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瑞氏染色法
5、染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造 良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合 液，不可先加染液。
6、染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用 甲醇脱色。
7、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。 8、瑞氏染液的质量好坏除了用血涂片实际染色效果评 价外，还可采用吸光度比值RA评价。瑞氏染液的成熟指数 以RA（A650nm/A525nm）=1.3±0.1为宜。
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中性杆状核粒细胞 中性分叶核粒细胞
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网织红细胞染色方法
❖ 二、操作： 1、取小试管一支，加入新亚甲蓝染液2滴。 2、加入末梢血或EDTA抗凝静脉血2滴于上述试管中，
混匀。 3、室温下放置15min后，取1滴制成薄片。 4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数量。 5、计算： 网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞
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瑞氏染色法
❖ 三、操作： 1. 制作血液或脱落细胞涂片，自然干燥固定； 2. 用蜡笔在血膜两头划线，滴加瑞氏染液3～5滴以覆盖 整个血膜，固定1～2分钟；滴加等量或稍多的缓冲液（未 加缓冲液涂片上有染料颗粒残留），吸球吹匀或摇动玻片 染色5～10分钟； 3. 用流动水从玻片的一侧冲去染液，自然干燥（或滤纸吸 干）； 4. 镜检。
❖ 一、基本原理： 革兰染色是细菌最基本的染色法，可用于标本涂片或
菌落涂片。细菌的等电点较低，约在PH2-5，一般情况下 细菌带负电荷，易于被带正电荷的碱性染料（结晶紫，碱 性复红）着色。染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和 革兰阴性（红色）两类。
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革兰染色法
❖ 二、方法： 涂片→干燥→固定→染色过程如下： 1、涂片经火焰固定后，加结晶紫液染1min，清水冲去
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瑞氏染色法
❖ 二、细胞着色原理： 既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞
成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血 红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合 ，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、 嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合， 染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态 与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、 原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染 成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物 质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻 底消失后，染成粉红色。
数/1000； 网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数*红细胞
数/L
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网织红细胞染色方法
❖ 三、注意事项： 1、活体染色时间不能过短。室温低时，放37℃恒温箱。 2、最好制两张片，每张计数1000个红细胞，避免分布不 均引起的误差，涂片要薄而均匀，不使红细胞重叠。 3、为计数方便，可于目镜中放一中间有孔硬纸片或用 Miller窥盘，缩小视野便于计数。 4、用瑞氏或瑞氏-吉姆萨染液复染后，可使网织红细胞计 数结果减少。 5、染液与血液比约为1：1，严重贫血时可适量增加血液 的比例。
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瑞氏染色法
❖ 四、注意事项： 1、PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为
两性电解质，所带电荷随溶液PH值而定。在酸性环境中正 电荷增多，已与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与 美蓝结合，染色偏蓝。因此，应使用清洁中性的载玻片， 稀释染液必须用PH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。
嗜酸性粒细胞
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嗜碱性粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
网织红细胞染色方法
❖ 一、概述： 根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型：
花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经 体外活体染色后，显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或 具有线网状结构的无核红细胞，即为网织红细胞。WHO 推荐使用新亚甲蓝染色液，因其对网织红细胞染色力强且 稳定而被首推。
常用的染色方法
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主要内容
❖瑞氏染色法 ❖网织红细胞染色方法 ❖革兰染色法 ❖抗酸染色法
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精品资料
瑞氏染色法
❖ 一、概述： 瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料
由酸性伊红和碱性美蓝组成，美蓝和伊红的水溶液混合后 ，产生一种不溶于水的伊红化美蓝中性沉淀（ME），即 瑞氏染料。将适量的ME溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液 。
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Miller窥盘法
❖ 由于目测计数误差较大,用Miller 窥盘法可减低标准误,特别是 RBC较少时.
❖ 盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上 划出格子:大方格内Ret/(小方格 内RBCx9)X100%
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网织红细胞
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革兰染色法
色脱落为止，水洗。 4、加复染液（碱性复红液），染30s，水洗。 5、干后镜检。
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革兰染色法
❖ 三、注意事项： 1、涂片：菌液涂片时，用接种环蘸取菌液直接在玻片
上涂布；若是菌落，先取生理盐水1滴，置于玻片上，用 接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
2、干燥：制备的涂片应自然干燥。 3、固定：多采用加热固定，目的在于保持细胞原有的 形态和结构，杀死细菌，使染料易于着色，并是细菌附着 于玻片上不易脱落。自然冷却后在染色。 4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性 菌。因此必须严格把握脱色时间。
2、染色的时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细 胞数量成正比。
3、冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉 淀在血膜上。
4、如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需 立即用水冲掉甲醇，以免脱色。
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瑞氏染色法
5、染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造 良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合 液，不可先加染液。
6、染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用 甲醇脱色。
7、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。 8、瑞氏染液的质量好坏除了用血涂片实际染色效果评 价外，还可采用吸光度比值RA评价。瑞氏染液的成熟指数 以RA（A650nm/A525nm）=1.3±0.1为宜。
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中性杆状核粒细胞 中性分叶核粒细胞
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网织红细胞染色方法
❖ 二、操作： 1、取小试管一支，加入新亚甲蓝染液2滴。 2、加入末梢血或EDTA抗凝静脉血2滴于上述试管中，
混匀。 3、室温下放置15min后，取1滴制成薄片。 4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数量。 5、计算： 网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞
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瑞氏染色法
❖ 三、操作： 1. 制作血液或脱落细胞涂片，自然干燥固定； 2. 用蜡笔在血膜两头划线，滴加瑞氏染液3～5滴以覆盖 整个血膜，固定1～2分钟；滴加等量或稍多的缓冲液（未 加缓冲液涂片上有染料颗粒残留），吸球吹匀或摇动玻片 染色5～10分钟； 3. 用流动水从玻片的一侧冲去染液，自然干燥（或滤纸吸 干）； 4. 镜检。
❖ 一、基本原理： 革兰染色是细菌最基本的染色法，可用于标本涂片或
菌落涂片。细菌的等电点较低，约在PH2-5，一般情况下 细菌带负电荷，易于被带正电荷的碱性染料（结晶紫，碱 性复红）着色。染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和 革兰阴性（红色）两类。
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革兰染色法
❖ 二、方法： 涂片→干燥→固定→染色过程如下： 1、涂片经火焰固定后，加结晶紫液染1min，清水冲去
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瑞氏染色法
❖ 二、细胞着色原理： 既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞
成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血 红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合 ，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、 嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合， 染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态 与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、 原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染 成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物 质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻 底消失后，染成粉红色。
数/1000； 网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数*红细胞
数/L
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网织红细胞染色方法
❖ 三、注意事项： 1、活体染色时间不能过短。室温低时，放37℃恒温箱。 2、最好制两张片，每张计数1000个红细胞，避免分布不 均引起的误差，涂片要薄而均匀，不使红细胞重叠。 3、为计数方便，可于目镜中放一中间有孔硬纸片或用 Miller窥盘，缩小视野便于计数。 4、用瑞氏或瑞氏-吉姆萨染液复染后，可使网织红细胞计 数结果减少。 5、染液与血液比约为1：1，严重贫血时可适量增加血液 的比例。
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瑞氏染色法
❖ 四、注意事项： 1、PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为
两性电解质，所带电荷随溶液PH值而定。在酸性环境中正 电荷增多，已与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与 美蓝结合，染色偏蓝。因此，应使用清洁中性的载玻片， 稀释染液必须用PH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。
嗜酸性粒细胞
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嗜碱性粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
网织红细胞染色方法
❖ 一、概述： 根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型：
花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经 体外活体染色后，显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或 具有线网状结构的无核红细胞，即为网织红细胞。WHO 推荐使用新亚甲蓝染色液，因其对网织红细胞染色力强且 稳定而被首推。
常用的染色方法
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主要内容
❖瑞氏染色法 ❖网织红细胞染色方法 ❖革兰染色法 ❖抗酸染色法
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精品资料
瑞氏染色法
❖ 一、概述： 瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料
由酸性伊红和碱性美蓝组成，美蓝和伊红的水溶液混合后 ，产生一种不溶于水的伊红化美蓝中性沉淀（ME），即 瑞氏染料。将适量的ME溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液 。
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Miller窥盘法
❖ 由于目测计数误差较大,用Miller 窥盘法可减低标准误,特别是 RBC较少时.
❖ 盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上 划出格子:大方格内Ret/(小方格 内RBCx9)X100%
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网织红细胞
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革兰染色法