--第8章动植物细胞的大规模培养

虽然动物细胞能像微生物细胞一样进行大规模的 悬浮培养，但其培养过程又有自己的独特之处：
1) 对环境敏感，应着重解决供氧与细胞脆弱的矛盾； 2) 无菌要求高，常添加抗生素； 3) 常需提供细胞贴壁的载体； 4) 生长缓慢，发酵周期长； 5) 不能完全套用微生物反应的经验； 6) 产物浓度低，提取成本高； 7) 反应成本高，但其产品价格昂贵；
(1) 锚地依赖性细胞(anchorage-dependent cell) 它们需 要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长。大多 数动物细胞, 包括非淋巴组织细胞和许多异倍体体系的细 胞都属于这一类型。
(2) 非锚地依赖性细胞(anchorage-independent cells) 这 类细胞无需粘附于固相表面即可生长。血液、淋巴组织细 胞、许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于 这一类型的细胞。体外培养这类细胞时可采用类似于微生 物细胞的培养方法。
项目 大小 (μm)
细胞壁 细胞膜 全能性 细胞分化 悬浮生长 需氧量 (kLa, h-1) 营养需求 倍增时间 (h) CO2 需求 群体效应 接触抑制性 锚地依赖性 环境敏感性 种子密度 生长密度 产物分泌性能 产物浓度 含水量 (%) 产物类型
微生物细胞
植物细胞
1～10
10 ~ 100
有
有
有
优点： 1) 表面积/体积（S/V）大，因而单位体积培养液的细胞
产率高 2) 由于采用均匀悬浮培养，把悬浮培养和贴壁培养融合
在一起，具有两种培养方式的优点； 3) 可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况； 4) 培养基利用率高； 5) 放大容易，国外已有公司以1000 l规模培养人体二倍体
细胞来生产-干扰素； 6) 细胞收获过程不复杂； 7) 劳动强度小； 8) 培养系统占地面积和空间小。
8.1 动植物细胞与微生物细胞的差异
1. 对动物细胞而言，无细胞壁、营养要求高、生长缓慢、 大部分属锚地依赖性细胞，因此，对环境(pH、温度、溶 氧、剪切、压力等)敏感、培养基昂贵(需要Aa、维生素、 血清等)、培养时无菌要求高、若采用悬浮培养通常需浆 细胞依附在载体上(即微载体培养)。
2. 对植物细胞而言，虽有细胞壁，可象微生物一样进行悬浮 培养，但对环境的耐受力比微生物细胞差得多，而且通常只 有在高密度时才能分泌次生代谢产物，同样，生长缓慢，导 致培养是无菌要求高，但其营养要求较动物细胞简单。
有
无
有限分化
可以
可以,但细胞易聚集
高 (100～1000)
低 (20 ~ 30)
简单
复杂
0.5～5
15 ~ 100
有些生长需要
无
无
无
弱
敏感
单细胞
高 (109～1010 个/ml)
胞内外
胞内
高
低
～75
~90
酶、有机物、抗生素、酶类、 生物碱 、天然
色素、有机化合物等
动物细胞 10～100 无 有 有(功能) 有
因此，微载体培养技术是目前公认的最有发展前途的一 种动物细胞大规模培养技术。
动物细胞在微载体表面的贴壁生长机理
锚地依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历粘 附和贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。
动物 细胞
微载 体
靠静电引力 Hale Waihona Puke Baidu范德华力
粘附和贴壁
细胞与微载体 的接触机率
细胞与微载 体的相融性
理论上可采用提高搅 拌转速而提高两者的 碰撞频率来实现，但 实际上高转速将损伤 细胞且引起来不及贴 壁；通常的操作方式 是在贴壁期采用低搅 拌转速，时搅时停， 经数小时后，待细胞 附着于微载体表面时， 维持设定的低转速， 进入培养阶段。
长期以来，人们已能利用细菌、酵母、丝状真菌的大量培 养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。但是，数十年 来，人类对疫苗、单克隆抗体、酶、激素、长春花碱、毛 地黄毒苷、紫草宁、可卡因等的需求日益增加，利用传统 的生化提取技术已难于满足人类的需求。为此，人们试图 利用微生物的大规模培养技术，培养动植物细胞以生产这 些昂贵的生物制品，并向大型化、自动化和精巧化方向发 展，已成为现代生物技术的一个组成部分。
离子/共价交联法 双功能试剂
包埋法
动物细胞包埋在多孔载体内部，琼 脂糖凝胶 、海藻酸钙凝胶包埋法
微囊法
用一层亲水性的半透膜将细胞包 埋在珠状的微囊里，如聚赖氨酸/ 海藻酸法。
2、微载体培养技术
所谓微载体培养技术就是将动物细胞吸附在微载体 表面而进行的一种悬浮培养技术。
所谓微载体是指直径在60～250 m，能适用于贴壁细 胞生长的微珠。微载体一般是由天然葡聚糖或者各种 合成的聚合物组成。
第8章 动植物细胞大规模培养
动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下进行培 养和繁殖的过程。此时细胞虽然生长和增多，但不象体 内繁殖一样形成组织。组织培养是指从机体内取出组织 或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之 生存和生长，此时培养物可能保持组织分化和组织结构 或功能。在习惯上，由于体外培养技术最初以培养组织 发展而来的，所以动物学和医学上又往往用组织培养这 一术语泛指细胞、组织及器官在适当的培养条件下离体 生长的技术。1979年国际组织培养协会专业术语委员会 建议将组织培养的概念与细胞培养加以区分。
二、动物细胞培养技术
1、培养方法
贴壁培养
依附在固体载体表面的培养方法。有转瓶、 中空纤维、玻璃珠、微载体系统等 。
培
养
悬浮培养 细胞在反应器中自由悬浮生长的培养方法。
方 法
吸附法
将细胞吸附在固体吸附剂表面而 使细胞固定化的方法。
固定化 培养
共价贴附法
利用共价键将动物细胞与固相载 体结合的固定化方法 。
有些可以, 但多需要载体
低 (1～25) 复杂 15～100 大部分形成泡沫 有 有 有 非常敏感 105 个/ml 低 (106 个/ml) 胞内外 低 ～80
酶、激素 (疫苗、干扰素 等)、单克隆抗体等
8.2 动物细胞大规模培养
一、动物细胞培养过程的特征
动 物 细 胞 在 体 外 培 养 时 根 据 对 生 长 基 质 （ growth substratum）的依赖性差异, 动物细胞可分为以下两类：
微载体表 面的电荷 密度而不 是电荷性 质有关 。
生长
扩展成单层
与生长环境 有关。如所 处条件最优， 则细胞生长 快；反之生 长速度慢。