Boc法_固相多肽合成(精)
多肽固相合成法
多肽固相合成法
多肽固相合成法是一种非常先进和有效的生物技术，它可以将小
分子片段（aminoacids）通过有效的合成过程来组装成大分子蛋白质。
此方法的优势在于具有更高的产品纯度、更好的控制性和宽谱应用能力，这就使得它成为一种理想的合成工艺，用于进行大规模蛋白质合成。
多肽固相合成是以水热反应在固定相支持体上进行肽聚合的一种
技术。
大多数用于支持多肽合成的固定相支持体都是磷酸化的，其中
包括以下几种：豆粕、玉米粒和玉米淀粉等。
在支持体上，蛋白质分
子可以有效地固定，而未固定的氨基酸片段在溶液中自由移动。
在具体的实验操作中，通常会先将支持体上的肽段与氨基酸进行
磷酸化反应，然后用溶剂进行洗脱，最后将洗脱后的肽段以相同的方
式重新添加到支持体中，然后再将氨基酸加入进来，再经过多次迭代，洗脱，添加和磷酸化反应，最终即可实现所需的多肽的大规模生产。
多肽固相合成法在药物研发和生物组装方面有着重要的意义。
由
于它具有高效、稳定、可控性强的特点，在蛋白质的合成方面尤为有效。
通过这种方式可以实现蛋白质的大规模合成，从而实现药物筛选、精准药物设计、组装生物传感器、跨界复杂系统等。
因此，多肽固相
合成法可以说是现代药物研发和生物组装的重要技术基础。
多肽固相合成
多肽固相合成引言多肽是由氨基酸单元组成的生物大分子，具有广泛的生物活性和潜在的药物研发价值。
多肽固相合成是一种常用的合成方法，可以用于制备中小型多肽以及肽类药物。
本文将介绍多肽固相合成的原理、步骤和常用技术，并探讨其在药物研究领域中的重要性。
1. 多肽固相合成的原理多肽固相合成基于肽链从C端向N端逐渐延伸的原理。
合成过程中，多肽链通过戊二烯二硅烷（Boc）或氯甲酰（Fmoc）等保护基与固体载体（通常为氯甲基丙烯酸酯交联的聚合物）共价结合。
经过一系列的反应和保护基的去除，最终得到目标多肽。
2. 多肽固相合成步骤多肽固相合成步骤一般包括以下几个阶段：2.1. 准备工作首先，需要准备好实验室必备的试剂和仪器设备，并确保实验室操作符合安全要求。
此外，还需要选取合适的固相载体和保护基。
2.2. 固相修饰将固相载体与氯甲基丙烯酸酯进行反应，引入活性基团，以便后续与氨基酸单元的连接。
2.3. 保护基的引入选择合适的保护基（例如Boc、Fmoc）引入到固相载体上，以保护其反应活性。
2.4. 氨基酸单元的耦合将保护基的氨基酸单元与固相载体上的活性基团耦合，形成肽链的C端。
2.5. 保护基的去除通过适当的反应条件去除保护基，暴露出氨基酸单元的反应位点。
2.6. 重复步骤2.4和2.5重复步骤2.4和2.5，直到合成完整的多肽链。
2.7. 多肽链的剪切与脱保护将多肽与固相载体分离，并通过适当的反应条件去除保护基。
2.8. 纯化与鉴定对合成得到的多肽进行纯化和鉴定，通常使用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）等检测技术。
3. 常用的多肽固相合成技术多肽固相合成涉及到许多关键的技术，下面介绍几种常用的技术方法：3.1. Boc策略Boc策略是一种常用的多肽固相合成策略，其特点是生化反应条件温和，适用于氨基酸侧链中含有灵敏官能团的情况。
然而，Boc保护基的去除需要使用强酸，容易引起副反应。
3.2. Fmoc策略Fmoc策略是另一种常用的多肽固相合成策略，它与Boc 策略相比，具有更广泛的应用范围。
固相多肽合成技术
固相多肽合成技术固相多肽合成技术是一种用于合成多肽的化学方法，它在药物研发、生物技术和生物医学领域具有重要的应用价值。
本文将介绍固相多肽合成技术的原理、步骤和应用。
1. 原理：固相多肽合成技术是一种通过连接氨基酸单元来构建多肽链的方法。
它基于聚合物材料（通常是聚苯乙烯或聚乙烯二乙烯基苯）作为固相载体，通过化学反应将氨基酸单元逐步连接在一起，形成多肽链。
固相多肽合成技术的关键在于氨基酸单元的保护基团和活化剂的选择，以及反应条件的控制。
2. 步骤：固相多肽合成通常包括以下步骤：（1）固相载体的活化：将固相载体暴露在活化剂（通常是二硫代巴比妥酸或活化的二硫代巴比妥酸）中，使其表面产生反应活性位点。
（2）氨基酸单元的保护基团去除：将保护了氨基酸侧链的多肽载体与去保护试剂（如氢氟酸）反应，去除保护基团，使氨基酸单元处于活性状态。
（3）氨基酸单元的活化：将活性氨基酸单元与活化剂反应，形成活性酯或活性酸氯，使其能够与载体上的反应位点发生偶联反应。
（4）氨基酸单元的偶联：将活性氨基酸单元与载体偶联反应，生成多肽链的第一个氨基酸。
（5）重复步骤（2）至（4）：重复进行氨基酸单元的去保护、活化和偶联反应，逐步延长多肽链。
（6）多肽链的脱保护和洗脱：在合成结束后，通过合适的方法去除多肽链上的保护基团，并将多肽从载体上洗脱下来。
3. 应用：固相多肽合成技术在药物研发和生物医学领域具有广泛应用。
它可以用于合成生物活性多肽药物，如多肽激素、肽类抗生素和肽类抗肿瘤药物。
固相多肽合成技术还可用于合成多肽疫苗，用于预防和治疗传染病。
此外，固相多肽合成技术还可以用于合成具有特殊结构和功能的多肽，如融合蛋白、肽标记和肽纳米材料。
总结：固相多肽合成技术是一种重要的化学方法，可用于合成多肽药物、疫苗和其他生物活性多肽。
它基于固相载体和化学反应，通过逐步连接氨基酸单元构建多肽链。
固相多肽合成技术的应用领域广泛，对推动药物研发和生物医学研究具有重要意义。
多肽固相合成步骤
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Boc保护法_Boc基团（叔丁氧羰基）应用
Boc保护法_Boc基团（叔丁氧羰基）应用
Boc保护基团主要用于液相肽合成化学中的氨基的保护。
后来随着发展逐渐应用到固相合成多肽的方法中。
目前在有机合成尤其是多肽合成中，Boc作为重要的氨基保护基团通过各种稳定策略（如Boc/Z）以及Boc /Fmoc 的组合，仍然广泛应用。
Boc叔丁氧羰基
中文名称：BOC酸酐
类型：氨基保护剂
英文名：Di-tert-butyl pyrocarbonate
CAS :24424-99-5
分子式C10H18O5
分子量218.247
性状：可燃性液体
Boc氨基保护基的优点
Boc基团和Cbz基团是多肽合成中最常用的两种氨基保护基，而在固相合成中，氨基的保护多用Boc。
优势
1.Boc对碱水解，和许多亲核试剂稳定。
2.对催化氢解稳定，并更敏感
3.酸解时产生的产物不会带来副反应
4.Boc氨基酸大都可以得到结晶
Boc引用方法
游离氨基酸在碱性条件下（NaOH，NaHCO3）用二氧六环和水
的混合试剂可以和Boc2O反应得到Boc保护的基团。
且副产物容易除去。
Boc脱除
液相：可用TFA或TFA：CH2Cl2（1:1）脱除。
固相：1-2M HCl有机试剂，或HCl /二氧六环。
多肽固相合成操作方法
多肽固相合成操作方法
多肽固相合成是一种常见的化学合成方法，它包括以下步骤：
1. 准备固相树脂：选择适当的固相树脂，如Fmoc或Boc保护基的手性树脂。
固相树脂需要在合适的溶剂中进行膨胀处理。
2. 洗脱树脂：将固相树脂放入滤板中，用合适的溶剂进行洗脱，以去除树脂中的杂质。
3. 保护基去除：选择适当的去保护基试剂，将其加入到固相树脂中，去除保护基，暴露出氨基酸的羧基。
4. 洗脱树脂：将固相树脂放入滤板中，用合适的溶剂进行洗脱，以去除去保护基试剂和残留的保护基。
5. 活化剂加入：选择适当的活化剂，如DIC或HATU，并将其加入到固相树脂中，将氨基酸与活化剂形成酯键。
6. 活化剂去除：将固相树脂放入滤板中，用合适的溶剂进行洗脱，以去除活化剂和未反应的氨基酸。
7. 重复步骤3-6，直到合成多肽的所有氨基酸序列完成。
8. 最后的去保护基：在合成完成后，使用适当的去保护基试剂，将所有的氨基酸的保护基去除。
9. 洗脱树脂：将固相树脂放入滤板中，用合适的溶剂进行洗脱，以去除去保护基试剂和残留的保护基。
10. 反应产物收集：将固相树脂中的多肽产物收集起来，根据需要进行进一步的纯化和分析。
需要注意的是，以上是多肽固相合成的基本步骤，具体的操作条件和试剂选择会根据具体的合成需求和文献方法而有所差异。
因此，在进行多肽固相合成时，需要参考相关文献和有经验的操作指南。
固相合成法合成多肽的一般步骤
固相合成法合成多肽的一般步骤
固相合成法是一种常用的合成多肽的方法，它采用固定在固相载体上的起始氨基酸，通过循环的反应步骤逐渐扩大多肽链的长度。
下面是一般的固相合成多肽的步骤：
1. 选择合适的固相载体：常用的固相载体包括树脂或纳米粒子等。
载体上通常含有反应活性的官能团，以便于多肽链的延长。
2. 固相载体的活化：将固相载体与活化试剂（例如DIC、DCC等）进行反应，以提供反应所需的官能团。
3. 起始氨基酸的固定：将起始氨基酸与已活化的固相载体进行反应，使其固定在载体上。
4. 反应循环：重复以下步骤，逐渐扩大多肽链的长度：
a. 去保护基：使用适当的切割试剂去除氨基酸残基上的保护基。
b. 活化：将下一个氨基酸与已去保护的氨基酸残基进行反应，生成新的伸长部分。
5. 合成结束：在合成所需长度的多肽链合成完成后，将多肽链从固相载体上解离下来。
6. 去保护基：去除整个多肽链上的保护基，恢复对应的功能基团。
7. 纯化和表征：对合成得到的多肽进行纯化和分析，常用的方法包括高效液相色谱（HPLC）、质谱等。
需要注意的是，每一步骤都需要严格控制反应条件，遵循适当的化学法则和实验室操作规范，确保多肽的合成效果和质量。
多肽的固相合成_(经典版)
Diagram
•固相合成法的诞生
•多肽合成仪介绍
•活化基团Fmoc与tBoc
•多肽的不稳定
固相合成法的诞生
Max Bergmann 1932 Emil Fischer
有机化学家们
20世纪 50年代
1963
1902
1972 Lou Carpino
Merrifield
•到了 20世纪 50 年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包 • 1932 年， Max Bergmann 等人开始使用苄氧羰基 (Z) 来保护 α-氨基， 氨基， •到 1963 1972 年， Merrifield Lou Carpino 首次提出了固相多肽合成方法 首先将 9-芴甲氧羰基(FMOC) (SPPS) 用于保护 ，这个在多 α 括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也 •1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在 多肽合成才开始有了一定的发展。 其在碱性条件下可以迅速脱除， 10min就可以反应完全，而且由于其 肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅 取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论 多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢 反应条件温和，迅速得到广泛使用，以 BOC和FMOC这两种方法为基 速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革 基础。 命，并成为了一支独立的学科 ——固相有机合成(SPOS)。 础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完 善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合 成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
• 氨基及羧基保护 脱除 • 形成无保护的四 肽
• 缩合从N端延伸
固相多肽合成法
固相多肽合成法固相多肽合成法是一种重要的有机合成技术，广泛应用于生命科学和药物研究领域。
本文将生动、全面地介绍固相多肽合成法的原理、步骤以及相关的实用技巧，旨在提供对读者有指导意义的知识。
固相多肽合成法是一种将氨基酸按特定顺序连接成多肽链的方法。
其原理基于活性氨基酸的保护基团选择性去保护和连接，以及携带保护基团的固相载体的使用。
通过不断地重复去保护、连接和洗脱等步骤，可以逐步构建目标多肽链。
固相多肽合成法的步骤一般包括固相载体上的保护基团去除、活性氨基酸与载体连接、保护基团再次引入和洗脱。
其中，保护基团的去除通常使用酸或碱，而连接反应则采用酰化或聚缩反应。
保护基团的引入需要结合保护基团的选择性去保护和引入。
在固相多肽合成过程中，还要注意一些实用技巧。
首先，合成的多肽序列和长度应事先确定，以确保合成的成功。
其次，选择合适的负载度和载体类型，可以根据需要选择有机多孔载体或无机硅胶载体。
此外，保护基团的选择也是关键，需要兼顾去保护和连接反应的条件。
最后，在洗脱步骤中，适当选择洗脱剂和洗脱时间，以去除无关杂质并确保目标多肽的纯度。
固相多肽合成法在生命科学和药物研究中具有广泛的应用。
它可以用于合成具有特定生物活性的多肽药物，如肽激素、肽抗体和肽递送系统等。
此外，固相多肽合成法还可用于研究蛋白质、蛋白质结构和功能的相关研究。
总之，固相多肽合成法是一项重要的有机合成技术，可应用于生命科学和药物研究领域。
熟练掌握固相多肽合成法的原理、步骤和实用技巧，对于高效地合成目标多肽具有重要的指导意义。
希望本文的介绍能够为读者提供有益的知识和启发。
多肽固相合成法
多肽固相合成法多肽固相合成法文档# 多肽固相合成法## 引言多肽固相合成法是一种重要且广泛应用的生物化学合成技术，被广泛用于合成蛋白质、多肽及其他生物分子。
其独特之处在于通过将起始物质（resin）与氨基酸逐步连接，从而构建具有特定序列和结构的多肽链。
本文将深入探讨多肽固相合成法的原理、步骤及应用。
## 1. 原理多肽固相合成法基于聚合物树脂作为固相支持基质，通过将氨基酸单元逐步连接在上面，完成多肽链的合成。
其基本原理可分为以下几个关键步骤：### 1.1 固相支持物的选择多肽固相合成法的第一步是选择适当的固相支持物。
通常采用的是聚合物树脂，如乙二醇二甲基丙烯酸酯（Wang树脂）或氯甲基苯基聚苯醚（Merrifield树脂）。
这些树脂具有良好的化学稳定性和机械强度，能够承受多次反应的洗涤和溶解过程。
### 1.2 保护基策略由于氨基酸中的官能团较多，为防止在合成过程中出现不必要的反应，需要采用保护基策略。
典型的保护基包括Boc（t-butoxycarbonyl）和Fmoc（9-fluorenylmethoxycarbonyl）。
这些保护基在反应前易于引入，并在反应后容易去除，保护了氨基酸的反应性。
### 1.3 活性化和偶联在多肽固相合成法中，氨基酸需要被活化成能够进行反应的形式。
常见的活化试剂包括DIC（N,N'-二异丙基碳二亚胺）、HBTU（2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲）等。
活化后的氨基酸与固相支持物上的活性位点发生偶联反应，逐步构建多肽链。
### 1.4 脱保护和洗涤每一步反应后，需要进行脱保护步骤，去除氨基酸上的保护基，使其恢复反应活性。
同时，对固相支持物进行洗涤，去除未反应的物质，保持反应体系的纯净。
## 2. 步骤多肽固相合成法的步骤相对繁琐但严密。
以下为基本步骤的概述：### 2.1 预处理在多肽固相合成法开始之前，需要对固相支持物进行预处理。
这包括树脂的活化、保护基的引入和活性试剂的准备。
多肽固相合成法
英文解释: solid phase peptide synthesis 简写为SPPS在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。
由于R.BruceMerrifield 在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。
下面给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。
氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团（图中的X）保护的氨基酸共价连接在固相载体上。
在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。
然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。
重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。
最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。
固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。
化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。
Merrifield成功地合成出了舒缓激肽（9肽）和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶。
1965年9月，中国科学家在世界上首次人工合成了牛胰岛素。
多肽固相合成法固相合成法的诞生多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。
1902年，Emil Fischer 首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。
到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。
多肽合成研究进展
多肽合成研究进展[摘要]多肽是一类生物活性很高的物质。
本文从化学合成和生物合成两个方面综述了多肽的合成，介绍了固相合成、液相分段合成法、施陶丁格连接、天然化学连接、光敏感辅助基连接、可去除辅助基连接、化学区域选择连接、氨基酸的羧内酸酐（NCA）法、组合化学法、酶解法、基因工程法、发酵法等合成方法的原理及其优缺点，对多肽合成方法的发展及其中药资源领域的应用进行了展望，为相关研究提供参考。
多肽是一类介于氨基酸和蛋白质之间的物质，由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。
已发现存在于生物体内的多肽达数万种多肽是一种蛋白质的结构片段，能起到蛋白质的活性基团作用，是人体新陈代谢、调节活动的重要物质。
通过研究多肽的结构与功能之间的关系，进而了解多肽中各氨基酸系列的功能。
在进行化合物的设计时，尽可能选择短肽，以便提高其生理活性，并且减少临床不良反应。
在美国FDA1999年允许大豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能之后，随着人们对多肽中各氨基酸系列功能了解的不断深人及多肽药物和保健品的持续高速发展、多肽合成技术的日益成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药领域，多肽药物的开发越来越受到人们的重视，其市场需求也在日益增加。
本文对近年来多肽的合成方法与研究进展进行综述。
1.多肽合成的分类多肽的合成主要分为两条途径：化学合成和生物合成。
化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。
在合成含有特定顺序的多肽时，由于合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体，合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了合成目标产物的定向性。
多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。
多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。
逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。
片段组合法主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。
近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。
fmoc法和boc法
Fmoc法（9-氟米基氯甲酰酰胺法）和Boc法（tert-丁氧羰甲酰酰胺法）都是固相合成中的两种常用的保护基策略，用于合成多肽和蛋白质。
1. Fmoc法（9-氟米基氯甲酰酰胺法）：•原理： Fmoc法使用9-氟米基氯甲酰酰胺（Fmoc-Cl）或其衍生物作为保护基。
这个方法基于Fmoc的氨基保护作用，可以在多肽合成中选择性地保护氨基（氨基酸的N-末端）。
它的主要特点是易于去除，通常使用碱性溶液（例如，弗洛伊尔溶液，piperidine）来去除Fmoc保护基。
•优点：–Fmoc氨基保护基容易去除，不需要强酸。
–Fmoc反应比较温和，适用于多肽和蛋白质的合成。
–反应条件适中，适合用于自动多肽合成。
•缺点：–Fmoc法在反应条件下对半胱氨酸和组胺等特定氨基酸不够稳定，需要额外的保护策略。
–Fmoc法需要使用含氰基化合物的底物，这些底物需要谨慎处理。
2. Boc法（tert-丁氧羰甲酰酰胺法）：•原理：Boc法使用tert-丁氧羰甲酰酰胺（Boc-ON）或其衍生物来保护氨基，通常在氨基酸合成的开始阶段添加Boc保护基，然后使用强酸（通常是三氟甲磺酸，TFA）来去除它。
•优点：–Boc氨基保护基比较稳定，适用于多肽合成的早期阶段。
–Boc反应适用于多种氨基酸，不需要额外的保护策略。
•缺点：–Boc法在去除保护基时需要使用强酸（TFA），这可能对某些实验室条件造成腐蚀性影响。
–去除Boc保护基后，残留的TFA需要彻底去除，以避免对生物分子产生影响。
选择使用Fmoc法还是Boc法通常取决于合成的具体需求和合成策略。
有时也会采用混合策略，根据需要在合成过程中切换不同的氨基保护基。
这两种方法都在固相合成和化学生物学中发挥着关键作用。
多肽固相合成—Fmoc法与Boc法
多肽固相合成—Fmoc法与Boc法
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C 端（羧基端）向N端（氨基端）合成。
过去的多肽合成是在溶液中进行的，称为液相合成法。
现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品纯化的难度。
为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的，而羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。
多肽化学合成方法有两种，即Fmoc合成法和Boc合成法。
Boc合成法
Boc合成法是采用TFA（三氟乙酸）可脱除的Boc（叔丁氧羰基）为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。
合成时将一个Boc氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化，偶联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA（三氟甲磺酸）法。
用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等。
在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA脱Boc基时，有约1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽链越长，这样的损失越严重；此外，酸处理会引起侧链的一些副反应，Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。
Fmoc合成法
与Boc合成法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc（9-芴甲氧羰基）为α-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理。
多肽固相合成法综述
多肽固相合成法综述【摘要】：多肽是人体中重要的生命活性物质，其化学合成有着非常重要的意义。
多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域的重要的研究方法之一，近年来，由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点而得到了很大的发展。
本文介绍了多肽固相合成法的诞生、原理、分类、过程以及前景展望。
【关键词】：多肽；固相合成1 概述多肽是生物体内的具有特定功能的生命活性物质，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的，其分子结构介于氨基酸与蛋白质之间。
目前，多肽的化学合成法有液相法和固相法两种。
固相合成法由于其省时、省力、省料、便于计算机控制等优点在药物研发领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域表现出了显著的优越性并且在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。
2 多肽固相合成2.1诞生1963年，Merrifield首次提出了多肽固相合成法（SPPS）这个具有里程碑意义的合成方法，可以说它带来了多肽化学合成上的一次革命。
在这之前，大量科学家在多肽合成以及氨基酸保护方面取得了不少成绩，为多肽固相合成法的诞生提供了实验和理论基础。
60年代末，Merrifield发明了世界上第一台多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶-具有124个氨基酸的核糖核酸酶。
1984年，Merrifield也因为在多肽固相合成领域的突出贡献获得了诺贝尔化学奖。
2.2原理将所要合成的肽链的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体（高分子树脂）相连接，再以结合在固相载体上的氨基酸的氨基作为合成起点，脱去氨基保护基并同过量的活化羧基反应以延长肽链，不断重复这个步骤，即缩合成肽-洗涤-脱保护-洗涤-缩合成肽，直到得到目的肽链。
最后，将肽链从树脂上裂解下来，进行氧化折叠、纯化、化学修饰等步骤得到所要的多肽。
2.3分类多肽固相合成法有两种：一是Merrifield所建立的Boc合成法，它是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc(叔丁氧羰基)为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。
Boc法_固相多肽合成（精）
Boc法_固相多肽合成（精）Boc法固相多肽合成SPPS是以在不溶性聚合物支持体上按序添加ɑ-氨基和侧链保护的氨基酸为基础的。
而Boc法则是以易酸解的Boc基团作为N-ɑ-保护基团。
切除此保护基团后，下一个被保护氨基酸通过使用连接试剂或预先激活的受保护氨基酸衍生物添加上去。
多肽链的C端通过一连接体与树脂相连，其依赖于不同的连接剂的使用而被切割成为多肽酸或多肽酰胺。
通常选择性使用氨基酸侧链保护基团而使得切除树脂的同时切除这些侧链保护基团。
Boc基团用TFA切除。
肽基树脂的最后切除和侧链保护基团的切除需要使用强酸，在 Boc化学中使用HF酸或TFMSA。
DCM和DMF 是树脂脱保护耦联和洗涤的首选溶剂。
Boc法其缺点是反复使用TFA酸解脱保护会导致多肽复合物中易酸解的保护基团产生一些副反应，而且Boc基团的切割和脱保护要求使用危险的HF和昂贵的实验仪器，而这些都是研究者不愿使用的。
一般的Boc法固相合成方式描述如下。
一、树脂合成：1、 Peptide acid Merrifield Resin and PAM Resin2、 Peptide carboxamide MBHA Resin二、肽链合成：氨基酸的耦联同Fmoc SPPS 类似，不同的是氨基酸N末端保护基Boc 的脱除。
N-端Boc基团的切除：在HF切割以前须将 N-端Boc保护基团用TFA除去。
因为它不仅会阻碍后面的HF切割除去t-bu基团，而且还会通过离子交换切除所有肽链中Boc基团保护的氨基酸。
手工切割N-端Boc基团方法是用TFA/DCM比为1：1的溶液在室温条件下洗涤反应15分钟。
三、切割无水HF是多肽中Boc树脂切割的常用试剂。
在大多数Boc树脂多肽的所有的切割程序中HF是最通用和危害最小的。
其主要缺点就是它的高毒性和反应活性，因此必须使用防HF头罩及切割仪器。
其它的强酸如TFMSA和TMSOTF也能用来替换HF作为PAM和MBHA树脂的切割剂。
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Boc法固相多肽合成
SPPS是以在不溶性聚合物支持体上按序添加ɑ-氨基和侧链保护的氨基酸为基础的。
而Boc法则是以易酸解的Boc基团作为N-ɑ-保护基团。
切除此保护基团后，下一个被保护氨基酸通过使用连接试剂或预先激活的受保护氨基酸衍生物添加上去。
多肽链的C端通过一连接体与树脂相连，其依赖于不同的连接剂的使用而被切割成为多肽酸或多肽酰胺。
通常选择性使用氨基酸侧链保护基团而使得切除树脂的同时切除这些侧链保护基团。
Boc基团用TFA切除。
肽基树脂的最后切除和侧链保护基团的切除需要使用强酸，在 Boc化学中使用HF酸或TFMSA。
DCM和DMF是树脂脱保护耦联和洗涤的首选溶剂。
Boc法其缺点是反复使用TFA酸解脱保护会导致多肽复合物中易酸解的保护基团产生一些副反应，而且Boc基团的切割和脱保护要求使用危险的HF和昂贵的实验仪器，而这些都是研究者不愿使用的。
一般的Boc法固相合成方式描述如下。
一、树脂合成：
1、 Peptide acid Merrifield Resin and PAM Resin
2、 Peptide carboxamide MBHA Resin
二、肽链合成：
氨基酸的耦联同Fmoc SPPS 类似，不同的是氨基酸N末端保护基Boc 的脱除。
N-端Boc基团的切除：
在HF切割以前须将 N-端Boc保护基团用TFA除去。
因为它不仅会阻碍后面的HF切割除去t-bu基团，而且还会通过离子交换切除所有肽链中Boc基团保护的氨基酸。
手工切割N-端Boc基团方法是用TFA/DCM比为1：1的溶液在室温条件下洗涤反应15分钟。
三、切割
无水HF是多肽中Boc树脂切割的常用试剂。
在大多数Boc树脂多肽的所有的切割程序中HF是最通用和危害最小的。
其主要缺点就是它的高毒性和反应活性，因此必须使用防HF头罩及切割仪器。
其它的强酸如TFMSA和TMSOTF也能用来替换HF作为PAM和MBHA树脂的切割剂。
虽然比HF活性小，但是在使用它们的时候同样需加以注意。
此处仅介绍HF切割法。
3.1 切割前的树脂准备
多肽树脂切割前的准备对防止副反应的发生及切割和脱保护的完全起着相当重要的作用。
切割试剂和脱保护方法的选择不仅仅与所用树脂有关，而且同肽链的氨基酸顺序及其侧链保护基团的选择有关。
在合成前确定所用树脂和侧链保护基团适合于所用的切割方法。
所有树脂在切割前必须完全的洗净和干燥。
特殊情况处理:
1 His的Dnp保护基团的切割
如果肽链上含有His(Dnp，那么在对N-端Boc基团的切割前必须将Dnp除去。
Dnp保护基团的切除及一些His衍生物的细节处理:
1. 用最小体积的DMF溶胀树脂。
2. 用20mol的苯硫酚处理1-2小时。
3. 将树脂转移到黏结玻璃漏斗中，在用HF液体或TFMSA处理前以DMF，甲醇和冷乙醚频繁冲洗。
2 含Trp的多肽树脂的脱甲酰基作用
甲酰基对酸切割试剂稳定，可以用标准HF法提前切除。
虽然Trp中未加保护的吲哚环会由t-bu正碳离子引起烷基化作用而对HF切割产生影响，但是一些净化剂如吲哚已经被成功用来保护含Trp的多肽以免烷基化。
然而，吲哚可以在酸催化条件下缓慢与Trp二聚形成不可逆的吲哚环。
另一方面，虽然不大可取，还可以通过用高HF水溶液切割例如羟胺在pH9.0条件下切割两小时。
哌啶对含Trp(For多肽树脂的脱甲酰基作用:
1. 以体积比为1：10哌啶/DMF液放入圆底烧瓶中，并在冰浴中冷却。
2. 加入多肽树脂（1g/10ml），在00C下搅拌反应2小时。
3. 用DMF（5倍体积）洗两次，DCM两次，MeOH两次。
4. 用HF切割前高真空干燥上述所得树脂至少4小时。
3.2 HF 切割
警告：无水HF是一种具强腐蚀性和挥发性的有毒液体。
所有使用HF的程序中都要求在排风罩中使用耐HF仪器。
不要使用玻璃仪器，因为HF会使其快速溶解并
释放热量。
当使用HF时，必须佩戴眼罩，面具，橡胶挡板及手套。
吸进HF气体会导致死亡。
标准HF切割
HF切割一般是在0-50C下反应30-60分钟。
肽链如包含Arg（Tos）可能就需要更长的时间。
如果肽链中含有一些具复杂残基的氨基酸如Trp,Met,Asp,Glu和Tyr 等会给切割带来麻烦。
对于这些基团的一些处理方法可见于section1,page B1。
在切割和脱保护中时间和温度对尽可能减少副反应的发生起着相当重要的作用。
含有Asp/Glu(OBzl或Asp/Glu(OcHx的肽链切割温度必须小于50C以防止个别形成门冬酰胺。
降低温度会影响到侧链上保护基团的切割效率。
含有
Arg(Tos,Cys(pMeBzl和Lys(2-Cl-Z的多肽树脂在小于50C的切割反应很慢而且并不可取。
含有Arg(Tos的树脂要求在50C下切割2小时以上。
当含有His(Dnp或Trp(For时，得先做预切割试验。
净化剂在减少副反应的发生上起着重要作用。
在HF切割苯甲醚是一种常用的净化剂用来防止由t-bu和苄基阳离子引起的Trp的烷基化作用。
在DMS和p-甲苯硫酚的连接中，苯甲醚可以防止Met和Cys的烷基化作用。
如果肽链中含有Trp则应避免使用苯硫基甲烷，因为其阳离子的内收会使Trp吲哚环上的N烷基化。
标准HF切割法（0.2mmol）
1. 将多肽树脂，聚四氟乙烯管和净化剂混合物加入反应容器中。
含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚（10：1：1：0.2），而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚（10：1：1）。
2. 将盖子旋紧，切割前在冰的纯甲醇中冷却至少5分钟。
3. 在参照生产商的说明下蒸馏10ml的HF到瓶中。
因为含Arg(Tos的多肽切割会持续2小时以上。
4. 反应最后，通过氮气流蒸发HF和DMS。
5. 用TFA从树脂上吸取出切除下的多肽。
6. 负压下过滤移走树脂，用TFA洗树脂两次。
过滤筛选，加入8-10倍的冷乙醚。
有时需要蒸发大多数TFA以得到粗品的沉淀物。
7. 切割后期处理：肽的分离和处理可以用醚沉淀或离心的方法得到，对于水溶性肽，方法3-6可以用。
1）．沉淀，在真空下在Hirsch漏斗中用硬滤纸过滤沉淀的肽。
用冷醚冲洗沉淀物，在合适的缓冲溶液中溶解太。
然后冻干
2）．离心，加入少量体积的叔丁甲醚在残留物中做底，研磨，直到得到悬浮物，那悬浮物转移到一个干净的离心管中，密闭离心，自动离心机在这过程中是必须的，将醚从管中小心的倒出，用醚重复洗涤，溶解残留物在合适的缓冲溶液里，后冻干
3）．水溶性肽，沉淀后，加水到残留物中，然后把混合物转移到分离漏斗中，少量乙醇可能会用于助容。
4）．充分摇晃堵塞的漏斗，分散堵塞物，静止让两层分离，分离下层液（水）
5）．加多量水到漏斗中，重复步骤4三次，移去上层液，然后放置于干净的烧瓶中，将混合液移到分离漏斗中
6）．加少量的新配二乙基醚，重复步骤4二到三次，每次都把醚层移去，把水层放到分离漏斗中，收集水层到干净的烧瓶，冻干。
在以上描写的方法中，如果TFA是先用旋转蒸发移去的，肽收率经常可以增加，优于醚沉淀步骤，在大多数情况下，加醚后，肽会粘到反应瓶上，这时需要通过重复的醚洗涤，而净化剂的加入可以较为有效的阻止这种情况的发生。
注意，在所有上面的方法中，二甲基醚可以取代叔丁甲醚。
附：Boc法合成用氨基酸（HF切割）
Arg(Mts Arg(NO2 Arg(Tos Asp(OBzl
Asp(OcHx Cys(pMeBzl Cys(Acm Cys(pMeOBzl
Glu(OBzl Glu(OcHx His(Bom His(Dnp
His(Tos His(Z Lys(2-Cl-Z Ser(Bzl
Thr(Bzl Trp(For Tyr(2-Br-Z。