死活细胞鉴定

生物探究活动——鉴定植物细胞的死活

【实验目的】学习用质壁分离法和用活体染色法鉴定细胞死活

【实验原理】活细胞的原生质层具有选择透过性；而死细胞则为全透性。选择透过性是质壁分离的先决条件。因此能发生质壁分离的细胞就表示是活的，不能发生质壁分离的细胞则说明是死的。

死活细胞间不仅通透性不同，而pH值等情况也不同，它们对某些染料的反应明显不同。某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一方面，这些染料可使死细胞的结构染色，但不积累于液泡。所以可根据某些染料活体染色的情况来鉴定细胞死活。

【实验材料和用具】洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、1M蔗糖溶液、0.01%中性红溶液等。

【实验步骤】

1、用质壁分离的方法鉴定细胞的死活。

撕洋葱表皮细胞滴加1M蔗糖溶液，在显微镜下观察。细胞很快发生质壁分离，这就是细胞活着的证据。另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分离实验，结果看到已死的细胞不能发生质壁分离现象。

用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖溶液，能快速鉴定细胞的死活。

2、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。

取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锋利的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红溶液中，放置5-10分钟最后用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察。

活细胞的液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生质和细胞核被染色。撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。

为进一步鉴别细胞的死活，可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴1M蔗糖溶液，便可观察到活细胞能发生质壁分离，死细胞及只剩细胞壁的空细胞都有没有这种现象。

可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理，比较与活组织有何不同。

注：1台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。是一种低毒的活体染色剂，它只能透过质膜受损的细胞或死细胞，而正常的细胞能加以排除，即：死细胞着色而活细胞不着色。故用于死活细胞的鉴定。甲基蓝有类似的染色机理.

2死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。

3液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。

细胞染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。主要体现在：1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过，而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。

活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳

定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞燃料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡冻得被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂（参见脂肪细胞染色实验）。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。

【实验仪器及试剂】

血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、吸管

细胞悬液、台盼蓝、伊红、Nacl溶液

【实验步骤】

1、将培养箱中的培养皿取出；

2、先用肉眼，然后用显微镜观察培养的细胞。记录细胞悬液的

颜色是浅紫色；同时和其它组的培养皿进行对比，观察培养

液的颜色是否正常，同时分析原因；

3、敲打培养皿，使得贴壁细胞释放出来，旋摇培养皿，使细胞

充分悬浮；

4、取0.5ml细胞悬液，分别加入一滴台盘蓝，或1.5ml 伊红。轻

轻充分混合后，室温下染色二分钟。

5、在计数器上盖上盖玻片。

6、将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作

用扩散到计数区。

7、在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格

内死活细胞的数量。

【注意事项】

1、当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和

右方线上的细胞。

2、轻轻敲打培养皿的侧壁，不要用力过大，以免破坏培养皿；

3、染色过程要混合均匀，以免影响染色效果；

4、在细胞计数板上滴上细胞液时，量要适当，而且位置要适

当，不要过多，以免污染镜台和物镜；

5、在显微镜下观察时要轻微调节视野，观察到适宜的视野进

行计数统计；

此即为在一个视野中观察到的一个中格中的细胞数目，同时在观察时可以发现几乎所有的细胞都死亡，没有存活的细胞，细胞都已被染色而且由以上观察计数的实验结果可计算得：

细胞浓度=（27+22+20+33+18+30）×5×104 ×4=3.12×105（个/ml）。

【实验讨论】

1、实验进行过程中，动手同时又动脑，提高自己各方面的能力；

2、实验开始的培养皿中培养液的颜色，如果细胞进行代谢，则呈黄

色，如果没有进行代谢，则为浅紫色，与开始时的细胞液的颜

色一致；

3、用细胞计数板进行计数时，操作得当，不可盲目操作，思考怎样

做到最好，也可以多次操作，熟悉操作技

第一类 死细胞着色,使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易穿透活细胞的质膜进入胞内,但却能渗透死亡的细胞,使之着色。

①台盼兰(Trypan blue)0.5-1%的台盼兰,pH7.0-7.2,每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液,2 分钟后镜检,活细胞没有染上,死细胞全部被染成蓝色。

②苯胺兰(Aniline’ black) 0.05%的苯胺黑以 1:10 的量与细胞悬液混匀 1-2 分钟后,死细胞被染成黑色。

③伊红 Y,细胞悬液与细胞悬液混,2 分钟后死细胞被染成桃红色。

第二类 活细胞着色,多为碱性染料,如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料,由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的

结构上从而显色,即它们解离后带正电,其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。

①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1:2 混合,立即镜检活细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒 无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动。