紫外和荧光分光光度计详解

F0 1 K q 0 [Q] 1 KSV [Q] F


动态猝灭——猝灭剂与发光分子碰撞
静态猝灭——猝灭剂与发光分子结合 混合猝灭——动态、静态（解析困难）
F 1 K [Q] F
0
P nQ PQn
log F0 F logK A nlog[Q]f F

紫外和荧光分光光度计工作原理
紫外—可见分光光度计
基本结构：六个基本部分组成
光源
单色器
比色室
检测器
显示装置
放大器
光源：
发出所需波长范围内连续光谱，有足够光强度,稳定； 所用灯的不同提供光的区间范围也不同。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)
紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
猝灭公式：
小结
紫外和荧光分光光度计 工作原理和功能


检测器：光电管或光电倍增管。可将光信号放大并转为电信号。
荧光光谱仪工作原理示意图
相对应该强度
紫外-可见与荧光分光光度计工作原理区别：
其它附属设施

控温系统和装置 停留装置 固体样品架
仪器功能
VU—Vis仪

荧光光谱仪

光谱扫描（Em、Ex） 时间扫描 同步荧光和共振荧光
光谱扫描（吸收、透光率、 能量）
紫外可见光区：氙灯（190-800nm）
单色器：核心部件
将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜: 玻璃350～3200nm 石英185～4000nm 色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同； 特点：色散均匀，谱带宽窄不同；
λ1
白光 入射狭缝 准直透镜
棱 镜
聚焦透 镜
λ2
出射狭缝
光栅：
如果溶液和溶剂对光的反射有较大的差异，就会引起比尔定律的偏
离。
为了消除误差，要尽可能地使参比溶液与样品溶液的组成接近。
4、其它因素的影响：
检测器非线性响应、溶液pH值、光分解、
水解、温度等 对吸光度产生影响；
在选择参比溶液和显色剂时也要注意。
DAD（PAD）检测器分光光度计

二极管阵列检测器（DAD）
1、谱带宽度和溶液本身性质 溶剂的选择：
1、在测定的波长范围内吸收较少
2、不会与溶质（被测样品）起化学反应 3、挥发性较小
特殊样品：
1、会发射荧光的被测样品 2、非常混浊的一片
2、仪器性能与测量误差
仪器性能：仪器误差，杂散光干扰等，系统误差

误差引起透光率（T）产生误差△T， 浓度（C）也随之产生误差△C。

什么情况下浓度的相对误差△C/C最小？ 当T%=36.8%（A=0.456）时, 测量所引起 的相对误差最小。 T=20%-65%，A=0.2~0.8之间进行测量, 相对测量误差较小.
减少误差的方法 采取调节光径与浓度C的办法减少误差 差示光谱法（低浓度、高浓度）
T
3、光的反射
朗伯—比尔定律在推导过程中，曾经忽略了溶液对光的反射作用。


DAD检测器的灵敏度比通常的UA检测器约低一个数量级。
单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UA检测器为好。
F-4500 荧光分光光谱仪（日本 Hitachi）
荧光分光光谱仪

工作原理：光源的激发光照射到样品池中，激发样品中的荧光物质
发出荧光，被光电倍增管接受，最后以图或数字的形式显示出来。
紫外区一定要用石英杯，可见区可用玻璃杯。
检测器：（光电检测器）
常见：光电池、光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。
放大装置、转换器和记录仪：
将测量信息放大、显示并输出的装置。
单光束紫外可见分光光度计：
双光束紫外可见分光光度计：
光源—吸收池—单色器—DAD检测器—数据转换记录 全谱分析
偏离朗伯—比尔定律的因素：
在镀铝玻璃表面刻有数量 很大的等宽度等间距条痕
(600、1200、2400条/mm ) 特点：波长范围宽、色散均匀、分
辨性能好、使用方便。
平面 透射 光栅
透 镜
光屏
M1
分光原理： 光通过光栅， 发生衍射和干 涉而分光
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝

样品室
样品室：容纳各种光径的吸收池的装置和附件。 比色池：如：普通比色池、微量池、流动池等。

光源：高压汞灯或氙灯，在190nM-800nM范围，发射强度较大的连
续光谱。


激发单色器：置于光源和样品室之间的单色器（第一单色器）
发射单色器：置于样品室和检测器之间的为单色器（第二单色器。 样品室：石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
光源与检测器成直角安排，测量固体时，光源与检测器成直角。
又称光电二极管列阵检测器（PAD） PDA（photo-diode array） PDAD（photo-diode array detector） Diode array detector，DAD

20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。
一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光 每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝


定波长或多波长测定
时间扫描 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体样品
Baidu Nhomakorabea


磷光分析
时间分辨（荧光寿命） 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体、固体样品


荧光猝灭

猝灭：非光辐射跃迁 浓度猝灭：临界浓度 温度猝灭：T℃↑，发光强度降低