紫外和荧光分光光度计详解
紫外分光光度法和荧光分析法
1 Beer-Lambort 定律A=log T =Ecl *A为吸收度；
*T为透光率； *E为吸收系数（以 E *c为溶液浓度； *l为样品总厚度。
1% 1cm
表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值）
适用条件：入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体样品在同一波长 下，各组分吸光度具有加和性
吸收光谱
10-4-10-7g/ml
选择性
高
一般
应用
硫色素荧光法测定维生素B1
维生素B1 在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，在紫（365nm）
照射下呈蓝色荧光（435nm）通过与对照品荧光强度比较。即可测得供试 品含量（课本260页）
荧光分光光度法测定维生素E
采用同步荧光扫描法测定血清中维生素E，有效的消除溶剂拉曼 光谱的干扰，提高灵敏度和准确性。（课本277页）
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 （例子：课本366页）
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法 小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
紫外、荧光分光光度计说明
一、设备名称：RF-5301PC荧光分光光度计；二、使用原理1、荧光分光光度计由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
荧光是光致发光，任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。
荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。
荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。
由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。
有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
利用某些物质受激发出的荧光，其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的。
三、组成结构光源、光件、样品池、检测器、数据处理器1、荧光分光光度计图RF5301PC荧光分光光度计主要是由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器以及数据处理系统几部分组成1. 光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
2．激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
3．发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
4．样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
紫外可见分光光度计参数分析方法
紫外可见分光光度计参数解读——————————————光学系统————————————————一）检测器部分光学系统：通常是指光学系统的结构形式，目前，国际国内光度计行业常采用的机构为自准式和CT式两种结构，通常有单光束和双光束两种；二）光源系统：1. 仪器波长范围指光度计所能进行测试的波长最大值和最小值之差；2. 仪器波长准确度仪器显示波长与真实波长的接近程度，即仪器设定波长与实际波长的差值。
每台光度计都要在很多个波长点检查波长准确度；3. 仪器波长重复性波长重复性是仪器返回原波长的能力。
它体现了波长驱动机械和整个仪器的稳定性；4. 仪器光谱带宽(灵敏度，分辨力)指一个尖峰光谱带通过单色器出狭缝时，在检测器上所检测到的能量半宽度，用波长单位nm表示，从另一个角度理解这一概念会更通俗易懂：首先，单色器出狭缝不仅仅代表着狭缝的物理尺寸或几何尺寸，他还代表着光学意义，这就是光谱带宽，我们知道，来自单色器的光线不全是单一波长的光，而是一个狭窄的按波长大小顺序排列的光谱带，这一光谱带包含波长的多少，用光谱带宽来表示。
光谱带宽直接反应的是从单色器出来的光的单色性的好坏程度。
该指标与仪器的分辨力和灵敏度很相似，但又有所不同，他们从不同的侧面反应光度计性能的好坏。
分辨力是指仪器分辨两相邻波长大小的能力，假如，在相邻两波长处给仪器的输入端两个脉冲输入，在仪器的检测器上检测到的模拟信号，若信号的最小值低于最大值的80%，根据罗雷(Rayleigh)判据，就认为这两个波长是可分辨的。
实际测量时通常是用苯蒸气来测量和间峰谷)。
灵敏度是指在做低浓度测量时，当浓度改变一个单位时在检测器上所引起信号的变化量，它受校正曲线(标准曲线浓度为横轴，吸光度为纵轴)和仪器本身精密度的限制。
两种测量方法精密度相同时，校正曲线斜率越大越灵敏，而斜率相等时，精密度越高灵敏度越好。
需要指出的是，为了得到准确的测试结果，仪器的光谱带宽(Spectral Bandwith简称SBW)和分析样品的自然带宽(Natural Bandwidth 简称NBW)之比应小于, 这样可以得到% 以上的测量准确度。
紫外分光光度计
紫外分光光度计：工作原理：物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同。
因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
又因为许多物质在紫外-可见光区有特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法对这些物质分别进行测定（定量分析和定性分析）。
紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律。
利用物质的分子或离子对某一波长范围光的吸收作用，对物质进行定性、定量分析以及结构分析。
紫外分光光度法首先确定实验条件，并在此条件下测得标准物质的吸收峰以及其对应波长值（同时可获得该物质的最大吸收波长）；再在选定的波长范围内（或最大波长值处），分别以（不同浓度）标准溶液的吸光度和溶液浓度为横、纵坐标绘出化合物溶液的标准曲线得到其所对应的数学方程；接着在相同实验条件下配制待测溶液，测得待测溶液的吸光度，最后用已获得的标准曲线方程求出待测溶液中所需测定的化合物的含量。
使用范围：凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。
分光光度法只适用于微量组分的定量分析(稀溶液，浓度在线性范围内，（c ＜0.01 mol/L)，浓溶液中光吸收定律将发生偏离，最适宜的吸光度测量范围为0.2-0.8之间（此时误差小）。
波长范围：可见-紫外分光光度计。
其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。
主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。
光源：在仪器的波长范围内提供足够的、稳定的连续的光。
紫外分光光度法和荧光分析法..
波长紫外可见分光光度计
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 （例子：课本366页）
在溶液中，当荧光物质 的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系,即
IF=KC
光照 分子基态 辐射跃迁 荧光 激发态
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子 可见-紫外光源 分子荧光分析法 具有结构 由荧光强度可测物质的含量 原子特征光谱作光源 原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法 小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
导数分光光度法
导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、
紫外分光光度法和荧光分析法课件PPT
实验操作规范
仪器校准
在进行实验前，应确保紫外或 荧光分光光度计已经校准，以
确保测量结果的准确性。
样品处理
对于荧光分析法，样品应进行 适当的预处理，如过滤、离心 等，以去除杂质和悬浮物。
试剂纯度
实验所用的试剂应保证纯度， 避免杂质干扰实验结果。
操作顺序
在实验过程中，应按照规定的 操作顺序进行，避免因操作不
05
实验操作注意事项
安全注意事项
01
02
03
04
眼睛保护
实验操作过程中，应佩戴合适 的护目镜，以防紫外线或荧光
物质对眼睛造成伤害。
皮肤保护
操作紫外或荧光实验时，应穿 着长袖实验服，并佩戴手套，
以减少皮肤暴露。
避免吸入有害物质
实验过程中应保持室内通风良 好，以防有害气体积累。
废弃物处理
实验结束后，应按照相关规定 妥善处理废弃物，避免对环境
实验操作
实验操作主要包括样品处理、荧光激发和荧光测量三个步骤。样品处理是将待测物质提取、纯化、稀释等操作， 以便进行后续的荧光测量。荧光激发是通过特定波长的光激发样品中的荧光物质，产生荧光。荧光测量则是通过 光电倍增管等设备测量荧光的强度和光谱，并记录数据。
应用实例
01Biblioteka 0203环境监测
荧光分析法可用于水体、 土壤等环境样品中的重金 属、农药残留等有害物质 的监测。
人才培养与交流
1
2
加强紫外分光光度法和荧光分析法领域的人才培 养，提高专业水平。
3
加强国际间的学术交流与合作，推动该领域的快 速发展。
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紫外分光光度法和荧光分析法课件
目录
• 引言 • 紫外分光光度法 • 荧光分析法 • 比较与选择 • 实验操作注意事项 • 课程总结与展望
紫外分光光度计及液相色谱仪的原理及使用
一、紫外光谱与荧光光谱在产生原理上有何不同?荧光光谱有何特点?产生荧光光谱的先决条件是什么?1、紫外线光谱产生原理:紫外-可见吸收光谱是物质中分子吸收200-800nm光谱区内的光而产生的。
这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级跃迁,当这些电子吸收了外来辐射的能量就从一个能量较低的能级跃迁到一个能量较高的能级。
因此,每一跃迁都对应着吸收一定的能量辐射。
具有不同分子结构的各种物质,有对电磁辐射显示选择吸收的特性。
吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的,它属于分子吸收光谱。
跃迁所吸收的能量符合波尔条件。
当光照射在物质上时,其中某些光被选择性地吸收,当辐射能等于分子中的电子从低能态跃迁到高能态所需能量时,则分子对光产生吸收,即产生了分子吸收光谱。
荧光光谱产生的原理:物质分子吸收某一波长(激发波长)辐射能被激发后,电子以无辐射方式从高激发态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级并释放部分能量,再以辐射的方式释放另一部分能量,该辐射能(光)即为荧光,其波长为发射波长,而产生的光谱即为荧光光谱。
2、荧光光谱特点:(1)以荧光强度对激发波长作图,得到激发光谱;同样以荧光强度对发射波长作图得荧光光谱。
激发光谱与发射光谱的图形几乎是镜面对称。
(2)基于物质吸收光后仅释放部分能量来发射荧光,故发射波长大于激发光波长(3)荧光波长是不变的,光谱的形状与激发波长大小无关3、产生荧光光谱的先决条件是:(1)具有较强的紫外-可见光吸收(2)具有一定的荧光效率二、1、在紫外-可见光测试中所用的比色杯与荧光测试时用的比色杯有何不同?在紫外-可见光测试中所用的比色杯为两面透光,荧光测试为四面透光2、玻璃比色杯与石英比色杯各自的适用波长范围?有一个物质的最大吸收为254nm,另一物质的最大吸收为500nm,这两种物质分别可选用哪几种比色杯?玻璃:320nm以上石英:≥210nm第二种物质两种比色杯都可以用,第一种物质则只能用石英比色杯。
紫外、荧光光度计测定甲基红的发射光谱
紫外、荧光光度计测定甲基红的发射光谱一、目的与要求1．加深对紫外可见分光光度计和荧光光度计原理的理解;2．巩固紫外可见分光光度计和荧光光度计的基本操作。
二、方法原理紫外可见分光光度计分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。
根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比，比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比；如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响，即得朗伯-比耳定律。
即A=εbc，(A为吸光度,ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度)就可以采用标准曲线法对溶液进行定量分析。
荧光光度计物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光正比关系,即If光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
激发荧光物质的激发波长的选择通常为其最大吸收波长。
紫外、荧光光度计均由5个部件组成：①辐射源。
②单色器。
③样品室。
对紫外分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
④检测器，又称光电转换器。
⑤显示装置。
三、仪器与试剂1. PE LAMBDA 35 型紫外可见分光光度计2. F7000型荧光光度计3．试剂：甲基红、乙醇四、内容与步骤1．配制一定浓度的甲基红的乙醇溶液（约10-5 mol/L）。
分光光度计
14
双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通 过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的 透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 双光束分光光 度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池， 还能自动消除光源强度变化所引起的误差。 双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得 到两束不同波长1和2 的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸 收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸 光度差值。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干 扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏 度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。
六、紫外可见分光光度计的分析及应用
紫外可见分光光度计的定性分析 物质吸收不同波长的光的特性只与溶液中物质的结构有关，而与溶液的浓度无关不同的 物质，所得的吸收光谱曲线各不相同。因此，在分光光度法中，将吸收光谱曲线作为定性的依 据。 紫外可见分光光度计在定性分析上的应用
1,.用吸收谱图推测化合物的结构
6
二、、不同类型分光光度计的特点
荧光分光光度计 荧光分光光度计的优缺点；
1.灵敏度高
个数量级。 2.定性更可靠
检测限可达10-10～10－12g/ml,比紫外可见分光光度法低3～4
荧光物质具有激发光谱和发射光光谱，可提供荧光强度、
荧光效率、荧光寿命、等多种物理参数，特征性强，较单一图谱定性更为可靠。 3.干扰因素较多 对试剂、环境等实验条件要求严格，测量精密度较差。 能产生荧光的物质相对较少，但许
紫外和荧光分光光度计详解
检测器：光电管或光电倍增管。可将光信号放大并转为电信号。
荧光光谱仪工作原理示意图
相对应该强度
紫外-可见与荧光分光光度计工作原理区别：
其它附属设施
控温系统和装置 停留装置 固体样品架
仪器功能
VU—Vis仪
荧光光谱仪
荧光分光光谱仪
工作原理：光源的激发光照射到样品池中，激发样品中的荧光物质
发出荧光，被光电倍增管接受，最后以图或数字的形式显示出来。
光源：高压汞灯或氙灯，在190nM-800nM范围，发射强度较大的连
于光源和样品室之间的单色器（第一单色器）
发射单色器：置于样品室和检测器之间的为单色器（第二单色器。 样品室：石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。
一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光 每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝
DAD检测器的灵敏度比通常的UA检测器约低一个数量级。
单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UA检测器为好。
F-4500 荧光分光光谱仪（日本 Hitachi）
检测器非线性响应、溶液pH值、光分解、
水解、温度等 对吸光度产生影响；
在选择参比溶液和显色剂时也要注意。
DAD（PAD）检测器分光光度计
二极管阵列检测器（DAD）
又称光电二极管列阵检测器（PAD） PDA（photo-diode array） PDAD（photo-diode array detector） Diode array detector，DAD
紫外分光光度计分析PPT课件
5 分光光度计的维护和保养
（1）仪器工作环境
仪器应安放在稳固的工作台上，避免周围有强 磁场。室内温度：15-28℃，相对湿度： 45%-65%，室内不宜有腐蚀性气体，不宜光 线过强。
（2）仪器保养 ① 电压
一般为220V，在电压波动较大的实验 室，最好有稳压器。
② 光源
在不用时不要开光源灯，延长光源的使 用寿命。要注意及时更换光源不稳的灯泡， 更换时不要直接用手接触，以免沾上油污。
2）在吸收池中装入相同的溶剂，吸光度相同 即可成套，若不同可求出修正值后使用。
分光光度计的使用
（1）721型可见分光光度计 ① 检查各调节钮处于起始位置，接通电源，打
开样品室暗箱盖，预热20min。
② 选择调节至所需用波长，并调节相关波长的 灵敏档。
③ 用调“0”电位器调整电表于T=0%，安放 参比溶液（第一格）和待测液，盖上样品 室盖，拉动拉杆，使参比溶液在光路上时 调节“100%”电位器，使电表指针在 T=100%
管高200倍 目前紫外-可见分光光度计广泛使用光电倍 增管作为检测器
光电倍增管示意图
信号显示器
1 以检流计或微安表为指示仪表。 标尺分上下两部分：上半部分是透光度T 下半部分是吸光度A
2 数字显示和自动记录型装置。 直接数字显示可避免人为误读。
紫外-可见分光光度计类型及特点
按使用波长范围可分为 1 可见分光光度计 ：400nm-780nm
单波长双光束分光光度计 特点：能连续改变波长，自动比较样品和参
比溶液的透光强度，自动消除光源强 度引起的误差 适用：在较宽波长范围内获得复杂的吸收光 谱曲线的分析
双波长分光光度计
特点：可测定高浓度、多组分混合试样，浑 浊试样；精确度高，操作简单。
紫外分光光度计的使用原理和方法 ppt课件
助色团：是指带有非键电子对的基团，如OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等， 它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当 它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰
向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见 表3-4。
紫外分光光度计的使用原理和方法
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红移和紫移
在有机化合物中，常常因取代基的变更 或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长 λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表33)，向短波方向移动称为紫移。
2. 溶剂 注意如下几点：
（1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液 具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。
3. pH值
紫外分光光度计的使用原理和方法
17
1.5 紫外-可见吸收光谱的应用
紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量 分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、 结构分析。
1. 物质对光的选择性吸收
物质对光的吸收是选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础。
紫外分光光度计的使用原理和方法
6
通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。如图3-1；
致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均
造成光径不一致，从而与定律偏离。
紫外分光光度计的使用原理和方法
27
§3. 紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
紫外分光光度计的使用原理和方法
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1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源
紫外与荧光实验讲义
实验一绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数一.实验目的通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-V is的使用方法。
学习导数光谱计算方法及特点。
二.实验原理1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。
紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。
各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。
吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。
为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。
在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。
根据比尔定律：A = ε b c式中A—吸光度ε—摩尔吸光系数b—液槽厚度，单位：厘米c—摩尔浓度，单位：mol/l摩尔吸光系数可按下式计算：ε=A b c实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。
因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。
2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。
利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。
通常可以获得1-4阶导数光谱。
在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：ssd Acdλ∝。
其中s为导数的阶数。
因此，可以利用导数光谱进行定量测定。
导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。
由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。
三.实验仪器和试剂1.Agilent8453 UV-Vis分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.25ml容量瓶，50ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;5.去离子水四.实验步骤1.波长测定（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l, 苯丙氨酸720mg/l；（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm——450nm间测定他们的吸收光谱。
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。
必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为 0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。
常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。
2. 单色器，两个单色器。
3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束自动记录，快速全波段扫描。
可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。
3.双波长。
将不同波长的两束单色光(λ、λ1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
仪器分析作业：荧光、紫外、红外
傅立叶变换红外光谱仪曹文芳 1014061420一、仪器结构傅立叶变换红外光谱仪的工作原理图固定平面镜、分光器和可调凹面镜组成傅立叶变换红外光谱仪的核心部件－迈克尔干涉仪。
由光源发出的红外光经过固定平面镜反射镜后，由分光器分为两束：50％的光透射到可调凹面镜，另外50％的光反射到固定平面镜。
可调凹面镜移动至两束光光程差为半波长的偶数倍时，这两束光发生相长干涉，干涉图由红外检测器获得，经过计算机傅立叶变换处理后得到红外光谱图。
IRPresting-21型傅立叶变换红外光谱仪具300入射迈克尔逊密闭型干涉仪，单光束光学系统，空冷陶瓷光源，镀锗KBr基片分束器，温度可调的DLATGS 检测器，波数范围7,800～350cm-1，S/N大于40,000∶1（4 cm-1，1分钟，2,100 cm-1附近，P—P），具有自诊断功能和状态监控器。
可收集中红外、近红外、远红外范围光谱。
二、实验原理原理概述：红外吸收光谱分析方法主要是依据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息进行测定。
一束具有连续波长的红外光通过物质，物质分子中某个基团的振动频率或转动频率和红外光的频率一样时，分子就吸收能量由原来的基态振(转)动能级跃迁到能量较高的振(转)动能级，分子吸收红外辐射后发生振动和转动能级的跃迁，该处波长的光就被物质吸收。
所以，红外光谱法实质上是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。
将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来，就得到红外光谱图。
红外光谱图通常用波长(λ)或波数(σ)为横坐标，表示吸收峰的位置，用透光率(T%)或者吸光度(A)为纵坐标，表示吸收强度。
三、操作步骤1 、开机前准备开机前检查实验室电源、温度和湿度等环境条件，当电压稳定，室温为21±5℃左右，湿度≤65%时才能开机。
2、开机始终保持红外光谱仪右下侧黄色灯亮（除湿器指示灯）；开机时，首先打开右下侧仪器电源开关，此时绿灯亮，稳定半小时，使得仪器能量达到最佳状态。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
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检测器：（光电检测器）
常见：光电池、光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。
放大装置、转换器和记录仪：
将测量信息放大、显示并输出的装置。
单光束紫外可见分光光度计：
双光束紫外可见分光光度计：
光源—吸收池—单色器—DAD检测器—数据转换记录 全谱分析
偏离朗伯—比尔定律的因素：
检测器：光电管或光电倍增管。可将光信号放大并转为电信号。
荧光光谱仪工作原理示意图
相对应该强度
紫外-可见与荧光分光光度计工作原理区别：
其它附属设施
控温系统和装置 停留装置 固体样品架
仪器功能
VU—Vis仪
荧光光谱仪
光谱扫描（Em、Ex） 时间扫描 同步荧光和共振荧光
光谱扫描（吸收、透光率、 能量）
DAD检测器的灵敏度比通常的UA检测器约低一个数量级。
单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UA检测器为好。
F-4500 荧光分光光谱仪（日本 Hitachi）
荧光分光光谱仪
工作原理：光源的激发光照射到样品池中，激发样品中的荧光物质
发出荧光，被光电倍增管接受，最后以图或数字的形式显示出来。
紫外和荧光分光光度计工作原理
紫外—可见分光光度计
基本结构：六个基本部分组成光源单色器源自比色室检测器显示装置
放大器
光源：
发出所需波长范围内连续光谱，有足够光强度,稳定； 所用灯的不同提供光的区间范围也不同。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)
紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
什么情况下浓度的相对误差△C/C最小？ 当T%=36.8%（A=0.456）时, 测量所引起 的相对误差最小。 T=20%-65%，A=0.2~0.8之间进行测量, 相对测量误差较小.
减少误差的方法 采取调节光径与浓度C的办法减少误差 差示光谱法（低浓度、高浓度）
T
3、光的反射
朗伯—比尔定律在推导过程中，曾经忽略了溶液对光的反射作用。
如果溶液和溶剂对光的反射有较大的差异，就会引起比尔定律的偏
离。
为了消除误差，要尽可能地使参比溶液与样品溶液的组成接近。
4、其它因素的影响：
检测器非线性响应、溶液pH值、光分解、
水解、温度等 对吸光度产生影响；
在选择参比溶液和显色剂时也要注意。
DAD（PAD）检测器分光光度计
二极管阵列检测器（DAD）
紫外可见光区：氙灯（190-800nm）
单色器：核心部件
将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜: 玻璃350～3200nm 石英185～4000nm 色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同； 特点：色散均匀，谱带宽窄不同；
λ1
白光 入射狭缝 准直透镜
棱 镜
聚焦透 镜
λ2
出射狭缝
光栅：
在镀铝玻璃表面刻有数量 很大的等宽度等间距条痕
(600、1200、2400条/mm ) 特点：波长范围宽、色散均匀、分
辨性能好、使用方便。
平面 透射 光栅
透 镜
光屏
M1
分光原理： 光通过光栅， 发生衍射和干 涉而分光
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
样品室
样品室：容纳各种光径的吸收池的装置和附件。 比色池：如：普通比色池、微量池、流动池等。
1、谱带宽度和溶液本身性质 溶剂的选择：
1、在测定的波长范围内吸收较少
2、不会与溶质（被测样品）起化学反应 3、挥发性较小
特殊样品：
1、会发射荧光的被测样品 2、非常混浊的一片
2、仪器性能与测量误差
仪器性能：仪器误差，杂散光干扰等，系统误差
误差引起透光率（T）产生误差△T， 浓度（C）也随之产生误差△C。
光源：高压汞灯或氙灯，在190nM-800nM范围，发射强度较大的连
续光谱。
激发单色器：置于光源和样品室之间的单色器（第一单色器）
发射单色器：置于样品室和检测器之间的为单色器（第二单色器。 样品室：石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
光源与检测器成直角安排，测量固体时，光源与检测器成直角。
又称光电二极管列阵检测器（PAD） PDA（photo-diode array） PDAD（photo-diode array detector） Diode array detector，DAD
20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。
一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光 每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝
猝灭公式：
小结
紫外和荧光分光光度计 工作原理和功能
F0 1 K q 0 [Q] 1 KSV [Q] F
动态猝灭——猝灭剂与发光分子碰撞
静态猝灭——猝灭剂与发光分子结合 混合猝灭——动态、静态（解析困难）
F 1 K [Q] F
0
P nQ PQn
log F0 F logK A nlog[Q]f F
定波长或多波长测定
时间扫描 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体样品
磷光分析
时间分辨（荧光寿命） 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体、固体样品
荧光猝灭
猝灭：非光辐射跃迁 浓度猝灭：临界浓度 温度猝灭：T℃↑，发光强度降低