蔗糖酶测定方法
实验一 蔗糖酶活力测定
实验一蔗糖酶活力测定一、目的要求了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。
二、实验原理蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。
酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。
蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。
由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。
3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。
三、试剂和仪器（一）试剂1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。
乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。
将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。
1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。
2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100mL。
3、1mol/L NaOH。
(二)仪器1、电热恒温水浴锅。
2、721分光光度计。
1、秒表或手表。
四、操作方法1、标准曲线制备使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。
用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
土壤蔗糖酶的测定方法(一)
土壤蔗糖酶的测定方法(一)土壤蔗糖酶的测定方法简介土壤蔗糖酶是一种重要的土壤酶活性指标，其测定方法可以帮助我们了解土壤中有机质分解和糖类循环的过程。
本文将详细介绍几种常用的土壤蔗糖酶测定方法。
方法一：邻苯二甲酸缓冲法1.准备土壤样品和邻苯二甲酸缓冲液。
2.将土壤样品加入邻苯二甲酸缓冲液中，使样品均匀悬浮。
3.在恒温水浴中将样品搅拌一定时间，通常为1小时。
4.用酚酞指示剂进行滴定，直到溶液从紫色转变为粉红色。
5.记录滴定所需的酚酞滴定液体积。
6.根据滴定液体积和样品重量计算蔗糖酶活性。
方法二：多酚类抑制法1.准备土壤样品和多酚溶液。
2.将土壤样品与多酚溶液混合，使样品与抑制剂充分接触。
3.静置一段时间，通常为4小时。
4.加入邻苯二甲酸缓冲液和酚酞指示剂，进行滴定。
5.记录滴定所需的酚酞滴定液体积。
6.根据滴定液体积和样品重量计算蔗糖酶活性，与未添加抑制剂的样品相比较，计算抑制率。
方法三：重组蔗糖酶法1.准备土壤样品和蔗糖酶底物。
2.将土壤样品与蔗糖酶底物混合，使底物与土壤酶反应。
3.反应一定时间后停止反应，通常为30分钟。
4.加入试剂，使反应停止。
5.根据试剂的反应产物的浓度变化，利用分光光度法或其他适当方法测定蔗糖酶活性。
方法四：荧光素二葡萄糖测定法1.准备土壤样品和荧光素二葡萄糖底物。
2.将土壤样品与荧光素二葡萄糖底物混合，使底物与土壤酶反应。
3.反应一定时间后停止反应，通常为30分钟。
4.根据底物反应产物的荧光强度变化，利用荧光分析仪或其他适当设备测定蔗糖酶活性。
5.根据荧光强度的变化计算蔗糖酶活性。
结论通过以上介绍的几种方法，可以选择适合实际需求的土壤蔗糖酶测定方法。
无论是邻苯二甲酸缓冲法、多酚类抑制法、重组蔗糖酶法还是荧光素二葡萄糖测定法，都可以有效地测定土壤中的蔗糖酶活性，为土壤质量评价和农作物种植提供参考依据。
不同方法的选择应根据实际情况权衡利弊，以提高分析结果的准确性和可靠性。
蔗糖酶的测定
蔗糖酶的测定：
酶液制备：称取0.5g左右棉花材料，加入5ml,0℃左右0.1mol/L 的磷酸—柠檬酸缓冲液[PH—5.0]，碾磨。
在冰浴中提取0.5小时。
然后在4℃、223离心20min。
收集上清液。
磷酸—柠檬酸缓冲液[PH—5.0]
母液：A )0.1mol/l柠檬酸溶液（19.21g溶于1000ml）
B)0.2mol/l磷酸氢二钠溶液（53.65g Na2HPO4.7H2O）或
71.7g Na2HPO4.12H2O溶于1000ml)
A）:x ml +B）:y ml，稀释到100ml PH—5.0 x=24.3 y=25.7
酶活性测定:
以蔗糖为底物，反应总体积为2.5ml[含1ml、pH 5.0、0.2mol/L 的磷酸——柠檬酸缓冲掖，0.2ml lmol/L的蔗糖，0.05ml酶液和1.2ml 蒸馏水]。
酶活性低时适当增加酶液体积。
在30℃恒温水浴中保温lh。
加1ml DNS溶液(取6.3g DNS(3，5一二硝基水杨酸)加262ml 2（mol/l）克当量NaOH注入酒石酸钾钠(182g溶于500ml蒸馏水中)热溶液中，加重蒸酚5g，无水亚硫酸钠5g，加热至DNS溶解，冷却定容到1000ml，避光保存。
)
终止反应，在沸水浴中加热5分钟，立即放在冷水中使反应缓冲液冷却，540nm处测定吸收值。
在以上的混合液中加预先灭活的酶液为空白对照。
取20-100ug葡萄糖，加lml DNS溶液，加热5分钟，540nm处比色，绘制标准曲线。
计算酶的活力。
蔗糖酶活力实验报告
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
蔗糖酶活力测定
一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。
二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。
三、主要仪器及试剂四、操作步骤1．标准曲线制作（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。
冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。
（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。
（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。
2．酶活力测定取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。
取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。
然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。
冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。
五、实验结果活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1 个活力单位（U）酶活力的影响教师：XXX实验类型：基础学时：10(参考)内容：一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。
二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。
欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。
土壤蔗糖酶活性测定方法
土壤蔗糖酶活性测定方法方法一：邻苯二甲酸二甲酯(OMPA)法1.实验原理：邻苯二甲酸二甲酯(OMPA)可通过蔗糖酶催化水解产生对甲酚背氧钠（PMS），PMS与p-苯醌反应生成紫色物质，紫色物质的光学密度与蔗糖酶活性呈正相关关系。
2.实验步骤：1) 准备土壤样品：将土壤样品通过2mm筛分获得<2mm的土壤颗粒，取适量土壤加入含有0.01mol/L可溶性蔗糖溶液的无磷酸钠缓冲液中制备土壤悬浮液。
2) 补充试剂：将0.5%邻苯二甲酸二甲酯(OMPA)和0.1mol/L乙酰胆碱溶液准备好。
3) 催化反应：取50ml土壤悬浮液加入50ml离心管中，加入0.5ml 邻苯二甲酸二甲酯(OMPA)溶液和0.5ml乙酰胆碱溶液，摇匀后放置于恒温水浴中，在37℃下培养2小时。
4) 停止反应：加入0.5ml冷却剂（10%w/v次氯酸钠和10%w/v硼酸混合物）停止反应。
5) 比色：每个试管取1ml反应液加入4ml氢氧化钠溶液，并通过pH 试纸调整pH值为7-8，然后以1ml/分钟的速度加入1mol/L硫酸，同时记录反应液的吸光度。
6)计算结果：根据吸光度计算出土壤中蔗糖酶的活性。
方法二：葡萄糖法1.实验原理：葡萄糖测定法使用试剂酚氨试剂和葡萄糖酸嵌合物的形成来测定土壤中蔗糖酶的活性。
葡萄糖酸嵌合物的形成量与蔗糖酶活性呈正相关关系。
2.实验步骤：1) 准备土壤样品：将土壤样品通过2mm筛分获得<2mm的土壤颗粒，取适量土壤加入含有0.3mol/L蔗糖溶液的无磷酸钠缓冲液中制备土壤悬浮液。
2) 补充试剂：准备好酚氨试剂和0.3mol/L葡萄糖溶液。
3) 催化反应：取2ml土壤悬浮液，加入2ml酚氨试剂和1ml葡萄糖溶液，放置于37℃恒温水浴中，培养2小时。
4) 停止反应：加入5ml冷却剂（20%醋酸和20%硼酸混合液）停止反应。
5) 比色：每个试管取4ml反应液加入10ml硫酸进行酸化，然后以每分钟加入2ml五氯酚酸溶液的速度加入到试管中，同时记录反应液的吸光度。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
土壤蔗糖酶活性测定方法
土壤蔗糖酶活性测定1.原理采用3,5-二硝基水杨酸比色法。
该方法以蔗糖为基质, 基质在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖, 葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5-硝基水杨酸, 并在508nm波长下有最大吸光值。
2.测定方法①称取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中, 加入0.06 mL甲苯和1mL ph5.5磷酸缓冲液, 再加3mL 8%蔗糖溶液, 摇匀后加盖, 放进36~37℃的培养箱中进行培养24个小时；②培养完成后取出, 摇匀, 并于4000r/min离心5min；③取上层清液0.2ml于20ml玻璃管中, 并加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸, 再立即将玻璃管沸水浴中加热5min, 加热完毕后在自来水流下冷却3min；④将显色液体用蒸馏水稀释到5ml, 在508nm波长下比色, 记录吸光值。
3.蔗糖酶标准曲线的测定方法（1）葡萄糖标准溶液的配制a.饱和苯甲酸溶液的配制在洁净的烧杯中加入适量蒸馏水, 慢慢加入少量苯甲酸同时用玻璃棒搅拌, 直至苯甲酸溶解的同时出现析出的苯甲酸晶体为止。
b.标准葡萄糖溶液的配制称取500mg葡萄糖溶解于适量苯甲酸饱和溶液中, 并取100ml容量瓶用苯甲酸饱和溶液定容（5mg/ml）。
（2）.操作步骤a.取11支洁净20ml玻璃管编号0—10。
b.按下表加液编号: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10葡萄糖母液（ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07饱和苯甲酸（ml）0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13葡萄糖浓度（mg/ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.060.07吸光值（A508nm）0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.0061.176c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸溶液, 并立刻放入沸水浴中加热5min.加热后, 立刻将玻璃管在流动自来水下冷却3min.冷却完毕后, 用蒸馏水定容至5ml.d.将显色液在508nm波长下比色。
蔗糖酶的提取及活力测定
蔗糖酶的提取及活力测定啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定原理1、细胞破壁:就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁的方法也不同。
我们用的菌体(微生物)细胞破壁方法是:自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理 2、3(1)DNS试剂+ D-葡萄糖氨基化合物(还原糖) (棕红色)(2)在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系(可用于比色测定)，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
(3)该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。
试剂与器材恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。
3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯操作方法细胞破壁?抽提?两次乙醇分级?透析?装柱?洗涤?洗脱?收集酶活力峰?制冻干粉 ? 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力 ? 测定三种酶样品的蛋白浓度计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值关键步骤与注意事项乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样 ? 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向 ? 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。
酶活力测定及作图一定要准确。
蔗糖酶测定方法
蔗糖酶测定（比色法）：蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。
现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。
试剂1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。
2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。
3）8％蔗糖溶液。
4）甲苯5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。
再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。
操作步骤称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。
每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
实验4 蔗糖酶活力测定
蔗糖酶活力单位(u)：
蔗糖酶在50℃, pH4.5的条件下，每分钟水解产生1mg葡萄糖所需的酶量。
蔗糖酶比活力的计算： 酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单
位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一 种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶 制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入 800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.
甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以 后使用。 ② 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17）； ③ 5％蔗糖溶液； ④ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5； 四、实验器材与仪器 1、恒温水浴（25℃、100℃）； 2、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿； 3、试管、试管架； 4、移液管； 5、微量移液器：200μl、 1000μl；
比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含有的 酶活力单位数。
比活力＝活力单位/mg蛋白
三、实验材料与试剂 1、实验材料
蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 2、实验试剂 ① 3,5－二硝基水杨酸试剂；
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
蔗糖酶测定
蔗糖酶测定1.分析意义：蔗糖酶是根据其酶促基质----蔗糖而得名的。
又叫转化酶或β-呋喃果糖苷酶。
它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要的作用。
研究证明，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性。
如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关。
一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。
它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标。
2 方法选择及原理蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（滴定法或重量法）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量计算出糖的含量。
也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成的有色化合物进行比色测定。
还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。
3 比色法3.1试剂配制（1）20%蔗糖。
（2）甲苯。
（3）pH5.5醋酸盐缓冲液：取120ml冰醋酸用水稀释至1L（a），取164g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1L（b）。
将（a）与（b）二液按1：8混合再用电位计校正pH。
（4）0.2M Na2HPO4·12H2O。
（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a），再取200ml浓H2SO4加水800ml（b）。
使用前将两夜按1：1混合。
（6）铜试剂：取50g CuSO4·5H2O溶于500ml水中（a），取25g Na2CO3、25g酒石酸钾钠、20g NaHCO3和200g Na2SO4溶于水并稀释至1L再加几滴甲苯（b）。
使用前将两液混合。
（7）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58 O C条件下真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml甲苯酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。
再用标准液制成1ml含0.01—0.5mg葡萄糖的工作溶液。
3.2标准曲线绘制：葡萄糖标准溶液稀释成1ml含1mg还原糖工作液。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法综合引言：土壤酶活性是指土壤中特定酶在一定时间内分解特定底物的能力，是评估土壤生态系统功能和土壤肥力状况的重要指标。
土壤酶活性测定方法是研究土壤酶活性的关键手段之一、本文将综合介绍常用的土壤酶活性测定方法，包括蔗糖酶活性测定方法、过氧化氢酶活性测定方法和脲酶活性测定方法。
一、蔗糖酶活性测定方法：蔗糖酶是一种重要的有机磷酸酶，广泛存在于土壤中，能够水解蔗糖为葡萄糖和果糖。
测定土壤蔗糖酶活性可以反映土壤中酶的数量和活性。
1.提取土壤酶液：将土壤与玻璃棒研磨均匀，用0.5mol/L甘油缓冲液（pH6.8）溶解土壤，离心沉淀，得到土壤酶液。
2.酶活性测定：取一定量的土壤酶液加入蔗糖底物和缓冲液，在37℃恒温振荡下反应30分钟，用酒精停止反应，加入硫酸，取样测定比色液的吸光度。
3.统计分析：根据比色液吸光度与标准曲线对照，计算出土壤蔗糖酶活性。
二、过氧化氢酶活性测定方法：过氧化氢酶是一种氧化还原酶，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。
测定土壤过氧化氢酶活性可以反映土壤中氧化还原反应的发生情况。
1.提取土壤酶液：将土壤与甘油缓冲液混合，加入液氮使其冷冻破碎，离心沉淀得到土壤酶液。
2.酶活性测定：取一定量的土壤酶液加入过氧化氢底物和缓冲液，在25℃恒温振荡下反应一定时间，停止反应后加入酒精，用紫外分光光度计测定吸光度。
3.统计分析：根据吸光度与过氧化氢递减曲线对照，计算出土壤过氧化氢酶活性。
三、脲酶活性测定方法：脲酶是一种解脲酸酯的酶，能够水解尿素为氨和二氧化碳。
测定土壤脲酶活性可以反映土壤中氮循环的情况。
1.提取土壤酶液：将土壤与脲酸酯缓冲液混合，用玻璃棒研磨均匀，离心沉淀得到土壤酶液。
2.酶活性测定：将一定量的土壤酶液加入脲酶底物和缓冲液，在37℃恒温振荡下反应一定时间，反应停止后加入酒精，用比色法测定吸光度。
3.统计分析：根据吸光度与标准曲线对照，计算出土壤脲酶活性。
结论：以上就是蔗糖酶活性测定方法、过氧化氢酶活性测定方法和脲酶活性测定方法的综合介绍。
蔗糖酶的测定方法
鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃冰箱中的）↓加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。
Hepes：11.9150gNaCl：16.0gKCl：0.74gNa2HPO4·12H2O：0.543g葡聚糖： 2gEDTA： 0.3722gMgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g）↓四层纱布过滤↓12000g，4℃，离心20min，用石英砂配平↓弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解↓放置15min，用空管加水与离心管配平↓12000g，4℃，离心20min↓弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内↓透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes↓4℃冰箱内透析20h即为酶液1.AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水↓在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）↓520nm比色（比色前混匀）2.NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓沸水浴5min，流水冷却↓每管加21.5mL蒸馏水↓520nm比色（比色前混匀）3.蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）4.蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）。
蔗糖酶的测定原理
蔗糖酶的测定原理
蔗糖酶（Sucrase）是一种催化蔗糖（麦芽糖）水解为葡萄糖
和果糖的酶。
测定蔗糖酶的活性常用的方法是通过测定其催化蔗糖水解生成葡萄糖的速率来间接测定。
测定蔗糖酶活性的实验步骤如下：
1. 准备反应体系。
一般采用含有蔗糖酶的提取物或纯化酶溶液作为反应体系，同时加入含有蔗糖的缓冲液。
2. 加入底物。
将一定量的蔗糖溶液加入反应体系中，使反应开始。
3. 控制反应条件。
将反应体系保持在适当的温度和pH值下进
行反应，通常蔗糖酶的最适催化温度为37°C，最适pH为6.8。
4. 反应时间控制。
反应一定时间后，停止反应。
5. 停止反应。
通常通过加入一定体积的酸性溶液来停止反应，将剩余的蔗糖转化为葡萄糖和果糖。
6. 对产生的葡萄糖进行测定。
葡萄糖的测定可以采用多种方法，如酶促发色法、底物比色法等。
通过测定蔗糖酶催化蔗糖水解生成的葡萄糖的量，可以间接测定蔗糖酶的活性。
活性通常以每分钟生成的葡萄糖的微摩尔数来表示。
需要注意的是，在文中不能再出现和标题相同的文字，以免造成重复。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
蔗糖酶测定方法
蔗糖酶活性的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）（关松萌主编，《土壤酶及其研究法》）酶促反应试剂：（1）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4(11.867克Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中)0.5ml加1/15M KH2PO4（9.078克KH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5ml。
（2）8%蔗糖溶液（用pH5.5磷酸缓冲液配制）。
（3）甲苯。
测定试剂：（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N NaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
（2）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。
取500mg葡萄糖溶于100ml苯甲酸饱和溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。
再由此溶液稀释成1ml含0.01-0.5mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：分别取不同浓度葡萄糖工作溶液1ml于50ml容量瓶中，加入3ml二硝基水杨酸溶液，混匀后在沸水浴中加热5min，取出立即在冷水中冷却，用水稀释至50ml，于波长508nm处比色测定颜色深度。
以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制成标准曲线。
测定操作称5g风干土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中加热5min，取出立即在冷水中冷却3min（溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色），用水稀释至50ml，于波长508nm处比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
结果计算蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示：葡萄糖（毫克）=a×4式中a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数。
蔗糖酶的测定方法
鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃冰箱中的）↓加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。
Hepes：11.9150gNaCl：16.0gKCl：0.74gNa2HPO4·12H2O：0.543g葡聚糖： 2gEDTA： 0.3722gMgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g）↓四层纱布过滤↓12000g，4℃，离心20min，用石英砂配平↓弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解↓放置15min，用空管加水与离心管配平↓12000g，4℃，离心20min↓弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内↓透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes↓4℃冰箱内透析20h即为酶液1.AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水↓在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）↓520nm比色（比色前混匀）2.NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓沸水浴5min，流水冷却↓每管加21.5mL蒸馏水↓520nm比色（比色前混匀）3.蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）4.蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）。
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蔗糖酶测定（比色法）：
蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。
现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。
试剂
1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。
2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。
3）8％蔗糖溶液。
4）甲苯
5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。
再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。
操作步骤
称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。
每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
结果计算
以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：
Suc＝a·V·n/m
式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。