重组蛋白质表达、复性与纯化

•基因表达体系及优劣势 •大肠杆菌表达体系 •蛋白质的复性 •工作中经常碰到的问题
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
• 遗传背景清楚，基因工程操 作方便，商品化表达载体种 类齐全，表达效率高； • 基本不分泌，易形成包含体 (无正确折叠的立体结构)，无 加糖等修饰
• 亲和层析复性法, 水相二相法, etc
分子伴侣
(Molecular Chaperone)
A molecular chaperone is able to transiently bind and thus stabilize an unstable conformation of another protein, thereby facilitating correct folding by preventing misfolding and aggregation.
• T7-tag (MASMTGGQQMG) • HSV-tag (QPELAPEDPED) • S-tag (KETAAKFERQHMDS) • VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)
• HA-tag (YPYDVPDYA)
•
• Flag-tag (DYKDDDDK)
为什么要 Myc-tag (EQKLISEEDL) 加 tag ?
有可能以后能做到的事
在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 在大肠杆菌中生产人凝血IX因子 在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化
各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 帮助分泌到周质 可用亲和层析纯化 帮助可溶化
特殊的表达用菌株
• BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体 • M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体 • BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 • Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带thioredoxin reductase的 融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键 • BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 • BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect. Type II: chaperones with enzymatic properties accountable for acceleration of rate limiting steps of protein folding– PDI （protein disulfide isomerase）, PPI（ peptidyl-prolyl cistrans isomerase), etc
按启动子分
• • • • • lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导
常用表达载体
• pJLA50X系列; pcDNAII; etc • pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) • pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) • pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) • pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) • pBAD系列 (Arabinose诱导型) •pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
人PDI的结构特征
PDI 作用机理
Folding assistant/chaperone
PDI has been shown to catalyze reactivation of non-native proteins without disulfide bonds. This function is independent from the redox/isomerase function, as it has been shown to exist in vitro with several model substrates that do not contain disulfides in their native structure.
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
让表达产物可溶化
• 采用MBD融合 • 采用GST融合 • 采用CBD融合 • 采用thioredoxin融合 • 采用Origami等宿主菌 • 降低菌体培养的速度
温度 (15-30℃), 降低转速
让蛋白质分泌到间质去
• 采用CBD融合 (pET36/37) • 采用Dsb融合 (pET39/40) • 采用带pelB/ompT引导肽的载体
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达; • 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好; • 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
鸟类输卵管组织
• 分泌生产有天然立体结构的 蛋白质到蛋清，产量高，容 易贮存和运输，分离纯化方 便； • 实验成本低，饲养费用低； • 加糖方式可能与人有所不同
体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物
•
未命名
一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导 致容易进入细胞
融合蛋白的专一性切割
• • • • • • DTT: intein的↓Cys 溴化氰: Met↓ Thrombin: LVPR↓GS Factor Xa: IEGR↓ Enterokinase: DDDDK↓ PreScissionTM protease: LEVLFQ↓GP • Genenase I TM PGAAHY↓ • TEV protease: ENLYFQ ↓ G
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉 价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达 的组织特异性较难控制； • 表达量较难提高，分离纯化 不方便
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和 活性的蛋白质至乳汁，产量 高，分离纯化方便，特别适 合药用蛋白的生产； • 转基因动物制作花费巨大， 实验周期长
包含体蛋白质的复性方法
• 透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质 量少，浓度不能过高(容易产生沉淀) • 快速稀释法: 最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能 高(容易产生沉淀) • 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度 • 凝胶过滤法: 快速, 可重复性高, 不会产生 沉淀, 操作复杂一点
枯草杆菌
(Bacillus subtilis)
• 分泌蛋白质能力强，一般有天然 立体结构； • 无加糖修饰功能，培养液中蛋白 酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶 的水解； • 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其
他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
• 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构， 有加糖修饰功能；可进行染色体整合型 基因表达; • 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上 清多糖浓度高; • 商品化表达体系：
酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
Timed addition of PDI to reபைடு நூலகம்olding Fab/red.
昆虫细胞
• 可以病毒感染的型式在成虫中生产， 也可在体外培养细胞中生产蛋白; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加 糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
CHO细胞
• 可进行分泌表达，有天然 立体结构，加糖方式与人 体蛋白质完全一致； • 表达量不够高，培养成本 较高
(pET12/20/22)
• 采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) • 采用带SUMO融合
(pET SUMO, Invitrogen)
纯化方便: 先用 EDTA/蔗糖 溶液处理, 然后 5 mM MgSO4 洗出
各种用于抗体识别的标记
• His-tag (6-8 Histidine)
重要的原核表达质粒提供商
• • • • • • • • • • Novagen Stratagene Invitrogen BioLabs Qiagen Pharmacia Promega Clontech Roche Gibco/BRL
The protein folding Problem
How to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?
重组蛋白质的 表达、复性与纯化
复旦大学生物化学系 黄伟达 whuang@fudan.edu.cn，www.hwdlab.net 2005年12月8日于华东理工大学
为什么要重组基因表达？
1. 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白质功能研究 生物制药和疫苗生产 疾病的基因治疗 食品、化工用酶制剂 抗虫、抗逆植物改良 细胞代谢产物的富集