色谱法的分离原理和应用
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✓ 讨论 Rf与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性 质有关 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱 基本定性参数，说明组分的色谱保留行为
1）K↑大，Rf↓小 2）薄层板一定，对于极性组分
展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0< Rf <1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.2——0.8（常用）
◆ 1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易
气化和热不稳定性差的化合物难以分离。
◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏 度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）。
0.3——0.5（最佳）
2. 相对比移值Rs
Rs R Rff（ （参 组） ）原 原点 点到 到参 组考 分物 斑 中 心 斑 点 心 的 点 质 的 距 质 量 距 离 LL12量 中 离
• 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；
• 参考物可以是后加入纯物质，也可为样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围
可以大于或小于1
（三）吸附剂的选择 根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择） 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
（五）薄层板的制备
硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸，醇
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活 性， 选择适当极性的流动相
色谱法的分离原理 和应用
二、定义
色谱法(Chromatography)：利用组分在两 相间分配系数不同而进行分离的技术。
色谱法的分离原理
• 利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以 及在两相间分配系数的差异, 当两相相对移动 时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果 使混合物得到分离。
• 两相中，固定不动的一相称固定相(Stationary phase)；移动的一相称流动相(Mobile phase)，携带
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量)
3．分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻） 4．特点：分析快速、灵敏、显色方便 5．应用：药物杂质检查、纯度测定
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL10离
（六）定性与定量分析
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
三、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量的液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附的水 ✓ 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） ✓ 分离机制：同液-液分配色谱 ✓ 定性参数： Rf
样品流过整个系统的流体。
色谱发展史
◆ 100年前，俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。由Tswett创立的色
谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小 时至几天。
◆ 20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。
适用：分析酸性或中性物质
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
3. 聚酰胺
氢键作用 氢键能力↑强，组分越后出柱
（三）吸附剂和流动相的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质
➢ 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
❖ 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合 物的分析
❖ 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
经典液相色谱
一、液-固吸附色谱
（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）吸附剂和流动相的选择
（一）分离原理
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力 差异而实现分离
➢ Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
高效液相色谱知识
经典LC与HPLC比较
柱之内径 长度 填充材料粒度 使用压力 分离时间
经典LC 1~5cm 50~100cm 150µm~200µm 1~10atm 0.5h~天
（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质
1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
1. 硅胶
结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
特性：
1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
4. 三者关系图示：
组分
吸附剂
极性
活性小
非(弱)极性
活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
二、薄层色谱法
（一）概述 （二）定性参数 （三）吸附剂的选择 （四）展开剂的选择 （五）薄层板的制备 （六）定性与定量分析
（一）概述
1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
1）K↑大，Rf↓小 2）薄层板一定，对于极性组分
展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0< Rf <1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.2——0.8（常用）
◆ 1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易
气化和热不稳定性差的化合物难以分离。
◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏 度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）。
0.3——0.5（最佳）
2. 相对比移值Rs
Rs R Rff（ （参 组） ）原 原点 点到 到参 组考 分物 斑 中 心 斑 点 心 的 点 质 的 距 质 量 距 离 LL12量 中 离
• 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；
• 参考物可以是后加入纯物质，也可为样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围
可以大于或小于1
（三）吸附剂的选择 根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择） 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
（五）薄层板的制备
硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸，醇
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活 性， 选择适当极性的流动相
色谱法的分离原理 和应用
二、定义
色谱法(Chromatography)：利用组分在两 相间分配系数不同而进行分离的技术。
色谱法的分离原理
• 利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以 及在两相间分配系数的差异, 当两相相对移动 时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果 使混合物得到分离。
• 两相中，固定不动的一相称固定相(Stationary phase)；移动的一相称流动相(Mobile phase)，携带
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量)
3．分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻） 4．特点：分析快速、灵敏、显色方便 5．应用：药物杂质检查、纯度测定
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL10离
（六）定性与定量分析
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
三、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量的液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附的水 ✓ 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） ✓ 分离机制：同液-液分配色谱 ✓ 定性参数： Rf
样品流过整个系统的流体。
色谱发展史
◆ 100年前，俄国的植物学家Tswett创立了色谱法。由Tswett创立的色
谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小 时至几天。
◆ 20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。
适用：分析酸性或中性物质
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
3. 聚酰胺
氢键作用 氢键能力↑强，组分越后出柱
（三）吸附剂和流动相的选择：
依据被测组分、吸附剂和流动相的性质
➢ 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
❖ 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合 物的分析
❖ 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
经典液相色谱
一、液-固吸附色谱
（一）分离原理 （二）常用吸附剂 （三）吸附剂和流动相的选择
（一）分离原理
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力 差异而实现分离
➢ Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
高效液相色谱知识
经典LC与HPLC比较
柱之内径 长度 填充材料粒度 使用压力 分离时间
经典LC 1~5cm 50~100cm 150µm~200µm 1~10atm 0.5h~天
（二）常用吸附剂：多孔、微粒状物质
1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
1. 硅胶
结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
特性：
1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
4. 三者关系图示：
组分
吸附剂
极性
活性小
非(弱)极性
活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
二、薄层色谱法
（一）概述 （二）定性参数 （三）吸附剂的选择 （四）展开剂的选择 （五）薄层板的制备 （六）定性与定量分析
（一）概述
1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法