仪器分析-高效液相色谱法
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
仪器分析-色谱法
高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。
太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。
2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。
3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。
1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。
吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。
一般采用5~10μm的全多孔型微粒。
这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。
5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
4）应与所用检测器相匹配。
例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。
第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
仪器分析笔记 《高效液相色谱分析》
第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
仪器分析高效液相色谱法
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不 同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同 ，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进 行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸 等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性 物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效 果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等， 为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了 解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪 酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
仪器分析—高效液相色谱法
仪器分析—高效液相色谱法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和定量化学物质的分析技术。
它广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
HPLC的原理基于样品在流动相中的分配行为，通过调节流动相成分和流速，实现对样品中化合物的分离和定量。
HPLC的特点之一是分离效率高。
其分析柱内有高效填料，通常是细小颗粒的吸附剂，能够提供大的表面积，有效地增加了分析柱与流动相接触的面积，从而提高了分离能力。
此外，在HPLC中还可以根据需要选择适当的流动相，调节柱温和压力等条件，进一步优化分析条件，提高分离效果。
其次，HPLC的灵敏度高。
在HPLC中，使用的检测器通常有紫外-可见光谱法、荧光法、质谱法等。
这些检测器可以实现对特定化合物的高选择性检测，而且还能够对不同化合物进行同时检测。
对于低浓度的化合物，可以通过选择合适的检测器和优化分析条件，提高检测灵敏度，使得即使在样品中含量很低的化合物也能够被准确地检测到。
此外，HPLC在分析速度和样品处理方面也比较快捷。
与传统的柱色谱技术相比，HPLC使用的高压泵可以提高流动相的速度，从而缩短分析时间。
对于样品预处理方面，使用HPLC时只需要进行简单的处理，如溶解样品并过滤，就可以直接进入分析阶段。
这使得HPLC具有高通量分析的优势，能够在短时间内快速分析大量样品。
此外，HPLC还可与其他技术结合应用。
例如，HPLC-质谱联用技术可以实现对样品中化合物的分离和结构的同时鉴定，具有非常高的分析灵敏度和选择性。
HPLC还可以与色谱预处理、液相萃取和样品前处理等技术结合，提高样品的净化效果和检测灵敏度。
综上所述，HPLC是一种高效、灵敏和多功能的分析技术，被广泛应用于各个科学领域。
它的分离效率高，灵敏度高，分析速度快，样品处理简便，可以与其他技术结合使用，提高分析的效果和可靠性。
在今后的科学研究和实际应用中，HPLC将继续发挥重要的作用。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
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药典中的液相色谱检测器
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常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
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⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
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2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
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梯度洗提流程
溶剂A
溶剂B
电磁阀A
电磁阀B
溶剂A
溶剂B
高压泵A
高压泵B
混合室
混合室
泵
低压溶剂梯度方框图
高压溶剂梯度方框图
应用举例
3. 进样系统
六通进样阀结构示意图
4. 分离系统——色谱柱
包括柱管与固定相两部分 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm 凝胶色谱柱内径3～12mm 微柱内径1-2mm，长1-5cm 制备往内径较大，可达25mm 以上
100 50
R1
Re
0
m AU 35 30 25 20 15 10 5 0
m AU
10
20
30
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE15.D)
Rg1 Re
10
20
30
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE16.D)
（1）分离机理
正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极
性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化
合物。
分配机理：分配系数
Kp
[SiO2
R NH2 [x M]
x]
x为溶质，M为溶剂
反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极 性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用 最广泛
反相键合相色谱法的疏溶剂 机理：
用于分离分子大小差大于10%的样品
分离原理示意图
使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主 要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。
使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)，主 要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等） 分子量的测定
（2）固定相
软质凝胶：如交联葡聚糖等，水相分离生化体系， 适于低、中压操作
（4）应用
大分子的分离分析 聚合物分子量分布的测定
应用举例
1.聚乙二醇40000 2.聚乙二醇10000
第三章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
一、高效液相色谱法的特点
1. 高效液相色谱法概述
2. 高效液相色谱与气相色谱的比较
GC
HPLC
应用范围
热稳定、低沸点的 热不稳定、高沸点、
物质
离子型的物质
热力学理论
较成熟
正在发展中
分析成本
5．检测系统
紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 电导检测器
（1）紫外检测器
固定波长的紫外检测器 可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器
固定波长的紫外检测器
Z型流通池结构
可变波长的紫外检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器之三维图
二极管阵列检测器之Isoabsorbance Plot
与C-18类似，保留值略小 保留值小，适合肽类和蛋白质
保留适中，选择性不同。非极性、中等极性 化合物
选择性与硅胶类似，保留小，用途广
-NH2
二醇基 醚基
反相、正相
正相 反相、正相
分离糖类、核苷酸、固醇等
分离有机酸、排阻分蛋白质等 分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18强
聚苯乙烯基 反相
pH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长
78.5 0.89
21
10.2 0.37 0.37 0.25
溶剂的选择原则
溶剂具有稳定的化学性质 溶剂的选择与使用的检测器要有相容性 溶剂的粘度要小 溶剂的沸点不能太低 溶剂的纯度要高且价格便宜
溶剂选择分组
正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、 氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚 或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶 剂二氯甲烷
可
线性范围
104
105
最小检测量
μg
ng
对温度敏感度
敏感
低
溶剂使用情况 无限制 受限制
荧光 高选择
性 可
103 pg 低
受限制
电导 选择性
不可 104 ng 敏感 受限制
四、HPLC主要类型及其选择
化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法
1. 化学键合相色谱法
表O
面 Si O
O
Si C18H37
疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等 极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
常用固定相
类型 C-18
C-8 C-3,C-4 苯基
-CN
分离方式 反相、离子对
反相、离子对 反相 反相
反相、正相
应用特点
普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合 物、中等极性化合物
离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三 甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等
（3）应用
有机酸、有机碱特别是强酸 强碱的分析，如羧酸、磺酸、 胺类、酚类、药物、染料等
4. 离子色谱法
(1) 分离机理
试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应： 阳离子交换：树脂—SO3-H++M+=树脂—SO3-M ++H + 阴离子交换：树脂—NR3+Cl-+X-=树脂—NR3+X -+Cl -
滞留的流动相的传质阻力
高效液相色谱中的速率方程
H
2d p
Cd Dm u
(
Cm
d
2 p
Dm
Cs d
2 p
Dm
Cs d
2 f
)u
Ds
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
2. 对速率方程的讨论
选用细颗粒填料可获高柱效 流动相流速低，有利于达到高柱效 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 温度的影响 液膜厚度的影响
响应特性
选择性检测器，如芳烃类化合物的检测 灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器
应用举例
波长的选择
（2）示差折光检测器
结构
响应特性
通用性检测器 低灵敏度 基线易受温度的影响 不适合梯度洗提
不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不 同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。
离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样 离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检
测问题
双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制 器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二 是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。
反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及 其混合物等，以水为主体，加入质子接受体 甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。
应用举例
2. 液固色谱法
（1）分离机理
以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶 质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性 中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同 溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常 数的不同导致不同溶质得以分离。
荧光检测器
结构
响应特性
选择性检测器。如PAH，蛋白质 高灵敏度，比紫外高约1000倍 适合梯度洗提
应用举例
电导检测器
结构
响应特性
选择性检测器，对离子型化合物有响应 灵敏度高 受温度的影响 不能梯度洗提
（5）几种检测器特性比较
示差折光 紫外
应用范围
通用 选择性
可否梯度淋洗
不可
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
4. 高效液相色谱法的特点
高压 高速 高效 高灵敏度
5. 应用举例
人参 Ginseng
人参、西洋参与三七的鉴别
m AU 200
150
DAD1 C, Sig=203,16 Ref =360,100 (H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE14.D) Rg1
半刚性凝胶：较高交联度的苯乙烯、二乙烯苯共聚 物，有机相洗脱，可承受10Mpa的压力
硬质凝胶
高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法 多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法 羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法
（3）流动相
改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选 择原则是：溶解样品、与凝胶浸润、与检测器 匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（2）固定相
极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、 碳多孔微球等
（3）流动相
ε°越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通 过混合溶剂来得到
硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体， 加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱 强度。
可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、 乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂
AW BW ( A B )O
EAB
[ A B ]O [ AW ][BW ]
, 萃取系数
K
[ A [
B AW ]
]O
EAB [BW ]，分配系数
k EAB [BW ]
（2）固定相、流动相和离子对试剂
固定相：多为C18,C8反相键合相
流动相：以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水 -乙腈等混合溶剂
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
三、高效液相色谱仪
1. 高效液相色谱仪流程
高效液相色谱仪
2. 高压输液系统
往复泵原理示意图
往复泵
梯度洗提
梯度洗提
即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂 强度按照特定的变化规律增加。 优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范 围内。 缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决 于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。