生物化学大实验报告

生物化学大实验报告

——谌星生物学（基地）

【摘要】碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称，它的作用是催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。细菌碱性磷酸酶（BAP）是一种从大肠杆菌中分离纯化而来的一种酶，是分子生物学中常用的一种工具酶，它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,为了了解并掌握蛋白分离与纯化以及相关性质，进行了生物化学大实验的操作，涉及到SDS-PAGE检测表达蛋白、蛋白质印迹、亲和层析纯化、离子交换层析纯化、分子筛排层析测定活性BAP的蛋白质分子量以及BAP活力与比活力的测定。

关键词：细菌碱性磷酸酶分离纯化

一、材料与方法

1.1研究对象

本次选择的细菌为BL21大肠杆菌工程菌株，外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E. coli中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。

1.2研究内容

1.2.1 分子筛排阻层析测定活性BAP的蛋白质分子量

首先是凝胶处理，然后是装柱、联机、上样、标准曲线的制作和目的蛋白分子量测定

1.2.2离子交换层析纯化

通过亲和柱纯化后的样品可再通过离子交换层析进行纯化。先是装柱，然后上样、洗脱及收集，再使离子交换柱再生。

1.2.3亲和层析纯化

亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化的技术。

（1）. 过夜BL菌以1:50扩培比进行扩培，至OD600＝0.5，需190 r/min约1 h20 min，然后加入IPTG至终浓度为1 mM，于28 °C，160 r/min-190 r/min条件下诱导5 h。

（2）. 诱导表达后的菌体5000 r/min离心15 min，弃去LB培养基。按10:1体积比重悬于破碎缓冲液中（即starting buffer），5000 r/min离心10 min，弃上清，加入破碎缓冲液以及终浓度为1 mg/mL的溶菌酶，30 ℃温浴15 min。

（3）. 冰浴条件下，60％功率超声处理5 min，超声4 sec间隔12 sec；再用40％功率超声处理5 min，超声4 sec间隔12 sec。（超声要求：a.将菌液处理至清亮；b.始终保持低温环境；c.避免出现黑色沉淀）。

（4）. 将超声处理后的样品于4 ℃2000 r /min离心10 min，沉淀为细胞碎片，弃去。再于4 ℃12000 r/min离心10 min，上清为可溶性蛋白，沉淀即为包涵体。（如需纯化包涵体蛋白，沉淀可用破碎缓冲液冲洗两次，将1mL裂解液对应的包涵体溶于500 L 8 M/L尿素中）。将上清再次于4 ℃12000 r/min离心10 min，进一步除去杂质。除用于亲和层析纯化外，于4°C保存至少1mL可溶性蛋白粗提液用于碱性磷酸酶活力和比活力。

（5）. 镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白：

①将亲和层析介质用5柱体积灭菌超纯水冲洗；

②用5柱体积starting buffer进行平衡柱子；

③将5-10mL的可溶性蛋白样品上柱，并可反复过柱2-3次；

④用含30mM 咪唑的wash buffer冲洗约10-12柱体积；

⑤用3 mL含有300 Mm 咪唑的elution buffer洗脱目的蛋白，每500 μL收集1管（为增加洗脱效率，每收集500 μL后可用elution buffer孵育柱子5min）；

⑥SDS－PAGE检测蛋白纯化效果；

1.2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白

蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，且具有相似的形状，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶胶上排列。蛋白条带经考马斯亮蓝R250染色后形成肉眼可见的蓝色条带，并可用凝胶成像系统分析条带蛋白含量和相对分子质量。首先，配制分离胶，再配制5%浓缩胶，然后电泳，将电板从电池槽中取出，在凝胶成像系统中分析特异条带的位置和分子量。

1.2.5 蛋白质印迹

印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。

①取出凝胶，切去浓缩胶，分离胶也可以做适当裁减（电泳时最好使用预染Marker这样在以后可以检查转移效率）。用灭菌去离子水冲洗，然后放入转移缓冲液中浸泡平衡。

②戴乳胶手套将PVDF膜裁成和需印迹凝胶相似而略大的小块，用100％甲醇处理15S （不可超过），然后放入转移缓冲液中平衡15min。

③海绵垫2块放入转移缓冲液中浸泡到没有气泡；将滤纸裁成比凝胶和硝酸纤维素纸略大的片，共4片，转移缓冲液中浸湿，然后按以下顺序组装转移装置：阴极黑板－海绵垫－2层滤纸－凝胶－PVDF膜－2层滤纸－海绵垫－阳极红板。

④恒流80mA转移2.5-3h，可于冰水浴中操作。

⑤卸去装置，取出PVDF膜置于干燥滤纸上片刻，但勿使膜变干，然后转移到灭菌去离子水中。

⑥将膜转移至杂交袋中，加入5mL封闭液（5mL TBST+0.25g脱脂奶粉），排出气泡，封口，摇床上室温封闭2h，可以过夜。

⑦将杂交袋剪一小口，弃去封闭液，加入含有5uL一抗的封闭液5mL，排出气泡，摇床上室温摇动10min，4℃过夜做一抗孵育（或2-3h过中午）。

⑧将杂交袋剪一小口，回收一抗溶液并放于4℃（若使用已经超过1次则可以弃去）。用TBS漂洗膜洗3次，每次10min（摇床上）。

⑨加入含有10uL二抗的封闭液5mL，排出气泡，摇床上室温摇动1.5-2h做二抗孵育。

⑩回收二抗溶液并放于4℃（若使用已经超过1次则可以弃去）。用TBS漂洗膜洗3次，每次10min（摇床上）。取1片DAB片溶于37℃预热的10mL灭菌去离子水中，用前加入30％的H2O2 33uL，即终浓度为0.1％。将膜置于平皿中，倒入上述显色液，暗处显色5min，条带清晰后用灭菌去离子水终止反应，漂洗一遍，凝胶影像系统中迅速记录结果。

1.2.6 BAP功能检测——活力和比活力的测定

（1）酶活力的测定