过氧化物酶活性的测定

过氧化物酶活性的测定

一、实验目的

掌握酶活性的测定方法和原理。

二、实验原理

过氧化物酶是一种含铁卟啉的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化,其活性与呼吸作用、光和作用等一些生理过程有关。测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病历上一个常用的指标。

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

三、材料、设备和试剂

新鲜马铃薯块茎

容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研钵、试管架

UV-9200紫外可见分光光度计、天平、秒表

0.2M磷酸缓冲液（pH6.0）：将0.2M NaH2PO4溶液87.7ml与0.2M Na2HPO4溶液12.3ml混合

反应混合液

四、实验方法

4.1制备酶液：

4.2活性测定：

值为纵坐标，绘制酶促反应曲线，计算酶的相对活性。

过氧化物酶活性=(△OD470*Vt)/(W*Vs*0.01*t)[u/(g·min)]

其中：△OD470为反应时间内吸光值的变化；W为样品质量；t为反应时间；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时酶液体积。

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离种子蛋白质

一、实验目的

学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

二、实验原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小.当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k,b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量，从而根据分子量将混合蛋白质分离开。

三、实验仪器及试剂

材料：绿豆芽

试剂：

（1）丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液：22.2克Acr，0.6克甲叉双丙烯酰胺(Bis)，加水溶解并定容到100毫升，过滤后使用，4℃下可贮藏1-2个月。

（2）10% SDS溶液。

（3）10%过硫酸铵溶液。

（4）TEMED溶液。

（5）分离胶缓冲液：1.5MpH8.8的Tris—HCl缓冲液。将18.15克Tris用水溶解后，用6N盐酸调至pH8.8，定容到100ml。

（6）浓缩胶缓冲液：0.5MpH6.8的Tris—HCl缓冲液。将6克Tris溶解后，用6N盐酸调至pH6.8，定容到100ml。

（7）电极缓冲液：将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到100ml，pH应为8.3。

（8）样品缓冲液：将1克SDS，2毫升β-巯基乙醇，5毫升甘油和1毫升试剂6，用水溶解并稀释到50毫升。

（9）0.1%溴酚蓝溶液。

（10）已知分子量的标准蛋白（M<10万KDa）5种。

成分分子量（道尔顿）含量（ug/支）兔磷酸化酶B 97,400 40

牛血清白蛋白66,200 40

兔肌动蛋白43,000 40

牛碳酸酐31,000 40 胰蛋白酶抑制剂20,100 40 鸡蛋清溶菌14,400 40

（11）考马斯亮蓝溶液：称取0.25克考马斯亮蓝R—250，加入45毫升乙醇，10毫升冰乙酸和45毫升水过滤后使用。

（12）脱色液：37.5毫升冰乙酸，25毫升乙醇加水到100毫升。

（13）SDS的重结晶：50克SDS，加100毫升95%乙醇，70℃下保温溶解，趁热过滤后于低温下过夜结晶，用少量无水乙醇或乙醚洗两次，于真空干燥器内干燥。

四、实验步骤

4.1样品的提取：

4.2 SDS电泳

计算相对迁移率： Rm----相对迁移率

d------蛋白带移动距离

d0-----指示剂移动距离

相对迁移率（Rm）=蛋白质移动距离（d）/指示剂移动距离（d0）

分子量97400 66200 43000 31000 20100

LogM 4.988 4.821 4.633 4.491 4.303 4.158

d (cm)

d0(cm)

迁移率(Rm)