第二章 酶的生物合成与发酵生产

第二章酶的生物合成与发酵生产
酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。

酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。

酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。

生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶
第一节酶生物合成及调节
一、酶的生物合成
先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）
遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。

DNA具有基因的具有基因的所有属性。

基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。

核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。

1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。

即：细胞能否合成某种酶分子。

首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。

DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。

（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102
DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。

转录：见课件附图，书P102
定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。

模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNA
RNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止
补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图
E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）
全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。

RNA合成过程和RNA链的延伸图解见课件。

（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)
1、翻译：以mRNA为模板合成蛋白质的过程。

即以mRNA为模板，
以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作
用，合成多肽链的过程。

是将mRNA分子上的碱基排列次序转变为
多肽链上氨基酸排列次序的过程。

一个起始密码子：AUG，三个终
止密码子：UAA、UAG、UGA。

mRNA在细胞内含量很低，但种类非常多。

不同发育时期有不同的mRNA。

在mRNA分子中，三个碱基编码一种AA，被称为密码子（codon），多数AA有2～4个密码子。

tRNA（transfer RNA）是AA的转运工具，携带活化的AA到核糖体上。

种类很多，每种AA都有其相应的一种或几种tRNA。

其二级结构为三叶草型，三级结构呈倒L型，有反密码环，反密码环顶端均有三个核苷酸组成的反密码，与mRNA相应的密码互补结合。

还有接受AA的一端，称为AA臂（见课件）。

rRNA（ribosome RNA）是蛋白质合成的工厂核糖体是一种核酶，因E.coli的23S rRNA能够催化肽键的形成（90年代初），Cech等人证明rRNA能够自身切除内含子，Altman发现RNAase P能将大肠杆菌的tRNA分子从前体形成剪切为最终的功能形式。

所有生物的核糖体都是由大小不同的两个亚基组成的。

小亚基与mRNA结合，沿5′－3′方向移动；大亚基有A位和P位（见课件）
蛋白质生物合成是细胞代谢最复杂也是最核心的过程，其中涉及到200多种生物大分子参与作用。

2、翻译过程即蛋白质的合成过程（大肠杆菌）包括：氨基酸的活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止与释放、氨基酸的活化与转运。

①氨基酸的活化与转运
每一种AA均由特异的活化酶体系来激活，这种酶叫氨酰tRNA合成酶。

在氨酰tRNA合成酶作用下，AA与tRNA结合为氨酰tRNA。

反应式见powerpoint。

②在核糖体上合成多肽：包括起始、延伸和终止阶段
a、肽链合成的起始阶段，分为三步（课件附图）
b、肽链合成的延伸阶段
c、肽链合成的终止阶段
l
d、肽链合成的折叠和加工处理：肽链释放出来后，需加工形成完整的空间结构的酶或蛋白质。

二、酶生物合成的调节
酶的生物合成要经过一系列步骤，在转录和翻译过程中，究竟哪些因素对酶的生物合成起调控作用呢？研究表明，转录水平的调控对酶的合成至关重要。

定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。

意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。

（一）基因调控理论：P106
Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）
操纵子——基因表达的协同单位
调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。

调节基因常位于调控区的上游。

启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点：RNA聚合酶的结合位点、cAMP-CAP 的结合位点。

CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP)。

只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

cAMP-CRP复合物的作用示意图(见课件)。

操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。

结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。

(二)酶合成调节的类型：P105
1.诱导(induction)：按酶的合成受环境影响的不同分为
组成酶：合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶类。

如EMP途径中有关酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

只有在环境中存在诱导剂时，它们才开始形成，一旦没有诱导剂，酶的合成就停止。

2.阻遏(repression)
分解代谢物阻遏(catabolite repression)
反馈阻遏(feedback repression)
两者关系：本质上相同，区别在于酶合成调节体系受控制的程度不同。

在微生物育种中常用诱变手段使诱导酶转化为组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。

（三）酶合成的调节机制
1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。

酶合成诱导的现象：
已知分解利用乳糖的酶有：α-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。

实验：
（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；
（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；
（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。

A、乳糖操纵子的结构有活性的阻遏蛋白与操纵基因结合，使乳糖结构基因不能表达。

（powerpoint附图）
B、乳糖酶的诱导乳糖和有活性的阻遏蛋白结合成无活性的阻遏蛋白，不能与操纵基因结合，乳糖结构基因得以表达。

（见powerpoint附图）
2.酶合成的阻遏作用（末端代谢产物阻遏作用）：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成。

酶合成阻遏的现象：实验
（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在。

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。

色氨酸操纵子——酶的阻遏（课件附图）：
阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达；
代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达
酶的合成和诱导操纵子模型见课件。

阻遏作用机理与诱导作用的机理相似。

无阻遏物时，调节基因（R）产生的阻抑蛋白与操纵基因（O）的亲和力弱，不与操纵基因结合，已结合在启动基因(P)上的RNA聚合酶能顺利通过操纵基因到达结构基因，转录而合成酶蛋白。

当阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白育辅阻遏物特异结合，使其结构发生变化，使阻遏蛋白与操纵基因的亲和力增强，阻止了RNA聚合酶通过，时结构基因上的遗传信息无法转录，酶合成受阻。

3.分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。

待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie 或biphasic growth)。

这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。

此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。

三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育
1.诱变育种
(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型——选育营养缺陷型突变株
•解除反馈阻遏——选育结构类似物抗性突变株
•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2.基因工程育种
（1）改变细胞调节基因，使菌种由诱导性变为组成型
（2）增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。

（二）条件控制
1.添加诱导物包括酶的作用底物、反应产物和底物类似物，其中酶的底物类似物最有效，不能被酶作用或很少作用。

2.降低阻遏物浓度避免使用葡萄糖，采用较难利用的淀粉，避免培养基过于丰富，采用补料分批培养方式，分次流加碳源。

3.添加表面活性剂Ｐ110
采用诱导物或降低阻遏物浓度的方法存在成本问题和操作问题（流加易染菌），有时采用添加表面活性剂有时采用添加表面活性剂来促进酶的分泌。

原理：细胞内酶含量提高到一定程度，会被细胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂可使胞内酶未被分解即被释放到胞外，因为表面活性剂有助于改善细胞通透性。

4.添加产酶促进剂
酶促进剂对不同细胞、不通酶的作用效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度。

如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。

第二节酶发酵动力学
酶发酵动力学研究发酵过程中细胞生长速率、产物形成速率及环境因素对这些速率的影响，及研究生物反应速度的规律。

包括细胞生长动力学和产酶动力学。

一、细胞生长动力学
在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。

（课件附细胞生长曲线图）
人们对细胞生长动力学的研究，自20世纪40年代就已开始。

法国的莫诺德（Monod）于1942年首先提出了表示微生物生长的动力学方程。

营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型。

图2-4表示的是微生物生长的Monod模型(见课件)。

1.µ:比生长速率（1/h）（specific growth rate）
2µmax：最大比生长速率（1/h）
3S：营养物浓度（生长限制基质浓度）克/L
4.Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数克/L，或mol/L
Monod方程的前提：当培养物中只有一种限制性基质而不存在其他生长因素的限制时。

Monod方程并不是唯一的细胞生长动力学模型，还有许多人提出了许多动力学模型，
由于Monod方程较简单，所以应用更普遍。

P113
Monod方程式一个经验式，形势与米氏方程十分相似。

二、产酶动力学
（一）酶生物合成的模式
根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：
1.生长偶联型（又称同步合成型）即酶的生物合成与细胞生长同步。

特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。

如利用米根霉生产脂肪酶。

生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。

特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。

所对应的mRNA是不稳定的。

例如：枯草杆菌合成碱性磷酸酶，由于受其反应产物无机磷算的阻遏，而磷酸又是细胞生长必不可缺的营养物质，培养基中必然有磷酸存在。

当细胞生长一段时间后，培养基中的无机磷酸几乎被用完，无机磷酸的阻遏解除，酶才开始大量合成。

由于碱性磷酸酶对应的mRNA
不稳定，寿命只有30min左右，细胞生长进入平衡期后，酶合成停止。

（见powerpoint枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线）
2.部分生长偶联型（又称延续合成型）即酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。

特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏，所对应的mRNA相当稳定。

例如：黑曲霉生产聚丰乳糖醛酸酶，加诱导物乳糖醛酸，培养40h左右，细胞进入对数生长期；当培养80h左右，细胞进入平衡期，酶继续合成至120h左右。

（见powerpoint黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线）
3.非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。

许多水解酶的生物合成都属于这一类型，如抗生素、许多水解酶等。

特点：受分解代谢物的阻遏作用。

所对应的mRNA稳定性高。

例如：黑曲霉产生的酸性蛋白酶，细胞进入生长平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。

总结：
影响酶生物合成模式的主要因素
1）mRNA的稳定性
2）培养基中阻遏物的存在
酶生产中最理想的合成模式：P116
延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。

细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。

对于：
同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。

滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。

中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。

(二)产酶动力学P116
研究细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响。

细胞产酶动力学与细胞的生长速率、细胞浓度及细胞产酶模式有关。

几种产酶模式图见课件
动力学模型对发酵过程分析、过程优化和过程控制具有重要意义，必须在取得大量实验数据的基础上，才能得到合理可行的动力学模型和方程。

第三节微生物发酵产酶
利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程，大多数酶才用微生物生产，原因：P45
一、产酶微生物的分离和选育
1.优良产酶菌种应具备的条件P55
（1）酶产量高
（2）易培养（生长速率高、营养要求低）
（3）遗传性能稳定，不易退化
（4）易分离提纯
（5）安全可靠（不是致病菌）
2.常用的产酶微生物P46
3.产酶微生物的分离和筛选P56图示a-淀粉酶的筛选和蛋白酶产生菌的获得方法
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品,也可从菌种保藏机构有关研究部门获得。

2)富集培养:使天然样品中的劣质菌变为人工环境中的优势菌，方法：投其所好，取其所抗。

3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。

4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。

要求方法快捷简便（透明圈法）
5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

要求方法相对精确，反映产酶实际能力。

4.产酶微生物优良菌种的选育
•诱变育种
•原生质体融合育种
•基因工程育种
传统育种方法简单、投资少、收获大，但是缺乏定向性和盲目性，且基因变异的程度有限；基因工程育种可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交，这是一种人为定向的改造菌种的方法，目的性强，成功率高，为微生物育种带来了一场革命。

二.微生物发酵产酶方法
1.固体培养:特别适合于霉菌培养
2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式
3.固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器
三.微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。

2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。

第四节动、植物细胞培养产酶
与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。

图示动物细胞模式图、植物细胞结构。

植物、动物、微生物细胞的特性比较p127
三者之间的差异主要有：
•植物细胞>动物细胞>微生物细胞。

•动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。

•植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。

•植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。

•植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。

•植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。

一、植物细胞培养产酶
1.植物细胞培养的特点，提取法缺点p127
2.培养基特点：
①植物细胞生长需要大量无机盐（包括N、P、K、Ca、Mg、S等6大元素，Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种微量元素）。

②多种维生素(硫胺素B1、吡哆醇B6、烟酸、肌醇)生长素、分裂素。

③氮源一般为无机氮
④碳源一般为蔗糖
植物细胞常用的培养基，应用最广的是MS培养基和LS培养基。

MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。

LS培养基是在其基础上演变而来的。

3.培养方法：P129植物细胞的大规模培养方式－悬浮细胞培养
步骤与微生物细胞一样，分为三步：Ｐ129下
①细胞株的建立；包括外植体的选择与处理、愈伤组织的培养。

愈伤组织经单细胞分理出的优良无性繁殖系，经摇瓶培养得游离细胞供作种子。

(图示水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织)
②扩大培养：种子细胞多次扩大繁殖后，作发酵接种材料；
③大罐培养：生产所需植物产品。

培养方式：分批、半连续、连续；
外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。

愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。

4.培养条件的影响与控制
（1）温度：室温（25℃）。

（2）pH：微酸性范围（5～6）。

（3）通气与搅拌：适当。

（4）光照的控制：对光照强度、时间、波长有一定要求。

（5）前体的添加（饲喂）：增加次级代谢产物的产率。

（6）诱导子（elicitors）的应用：强化次级代谢物的生物合成。

5.植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。

在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。

(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D 和 1.2mg/L6-BA（苄基腺嘌呤）的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。

然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L 6-BA的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。

(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。

二、动物细胞培养产酶
1.动物细胞培养的特点P127.下
①细胞生长速度慢。

细胞倍增时间15～100h,易受污染，需添加抗生素。

②细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。

需控制温度、pH值、渗透压、通风搅
拌等条件，以免破坏细胞。

③反应过程成本高，产品价格贵。

用于珍贵药物的生产，产物分布细胞内外；培养基复
杂，须添加血清。

④细胞具有锚地依赖性。

⑤原代细胞一般繁殖50代即退化死亡。

2.培养基：动物细胞培养即大致分为三类P131
①天然培养基：早期采用。

血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液等成分复杂、来源有限，不适合大量培养基的需要。

②合成培养基：成分明确（AA、维生素、糖类、无机盐等），组分稳定，但需加入一定量的动物血清。

考虑到经济成本和血清供给，不现实。

③无血清培养基：基本合成培养基加生长因子（功能因子），成份明确；基本合成培养基加组织抽提掖，成份复杂，含量不确定。

无血清培养基的优点：P131下
①提高了细胞培养的可重复性，避免了血清批次之间差异的影响。

②减少了由血清带来的病毒、真菌如支原体等微生物污染的危险。

③供应充足稳定。

④细胞产品易于优化。

⑤避免了血清中某些因素对细胞的毒性。

⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰。

3.培养方法（动物细胞分悬浮型（癌细胞、血液细胞）、贴壁型）
(1)悬浮培养(suspension culture)
让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖的培养方法。

优点：操作简单，培养条件均一，保质供氧好，容易扩大培养规模。

但对于大多数具有锚地依赖性的动物细胞，不能采用悬浮培养方式。

(2)贴壁培养(anchorage-dependent culture)
让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方式。

优点与悬浮培养正好相反。

缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，保质和供氧较差。

⑶贴壁－悬浮培养(pseudo-suspension culture)
又称假悬浮培养，将悬浮培养和贴壁培养巧妙结合的培养方法，包括：
a、微载体培养(microcarrier culture)
将葡聚糖等微小颗粒加入到培养基，动物细胞可贴附在颗粒表面生长。

特点：贴附面积大，供细胞贴附生长繁殖；载体体积小，比重轻，可悬浮在培养基内。

b、包埋(entrapment)和微囊(microencapsulation)培养
与微载体的不同之处：细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体内。

优点：保护细胞免受剪切力的损害；实现动物细胞高密度大规模培养；有利于下游产物纯化。

c、结团培养(aggregate culture)
利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮法培养。

优点：操作简便，节省了用微载体的成本。

4.培养条件的影响与控制
（1）温度：一般控制在36.5℃.
（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。

（3）渗透压:应与细胞内渗透压相同。

（4）溶解氧：根据情况随时调节。