第二章 基因工程中常用的工具酶

第二章基因工程中常用的工具酶

限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割

DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化

核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接

核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成

核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割

核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰

其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

§2-1 核酸内切限制酶

定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）

一、限制修饰系统的种类（图）

二、限制性内切酶的定义、命名

1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。

2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

Eco RI—Escherichia coli RI

Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ

Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)

三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点

a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是

随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割

b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点

切割

c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分

子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应

d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，

又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性

四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点

(1)基本特点：

①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA

分子形成链的断裂；——识别序列

②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割

部位

③因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端

④此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子A TP，但需加入Mg++离子，而且

是从其识别序列内部切割DNA分子

⑤在结构上是一种单一的成分，即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同，不具有多种亚基成分；

(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶都能够

识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAA TTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构

(3)平末端与粘性末端

由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成——具平末端的DNA片段。

Blunt ends

两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesive ends

粘性末端概念(定义)：（图）

*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。

(4)限制酶的识别序列与切割频率

具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256

具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096

以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。

(5)同裂酶(isoschizomers)

识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI 就是一对同裂酶。同裂酶形成同样的末端。有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究DNA甲基化作用。

(6)同尾酶(isocaudamers)

一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。例如BamHI、BglⅡ、Sau3A等即是一组同尾酶。

BamHI GGA TCC

BglⅡAGATCT

Sau3A GATC

*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明：

但产生的重组体中原识别位点发生了变化。

(7)识别多核苷酸序列的酶

例如HindⅡ就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：

5'-CTPyPuAC-3'

其Py=嘧啶碱基C或T；Pu=表示嘌呤碱基A或G

五、影响核酸内切酶活性的因素

(1)DNA的分子特性

a.限制酶识别位点周围的碱基成分

b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。

c.完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性DNA需消耗更多的限制酶。

d.DNA的甲基化程度

完全切割不同来源的DNA样品所需的限制酶单位（图）

(2)酶切消化反应温度

a.最适酶切消化温度

不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活。

b.限制酶的星号活力

限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变(变更)的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。

(3)DNA纯度

酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性。因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响

六、核酸内切限制酶对DNA的消化作用

应用X射线晶体学技术，测定限制酶－DNA复合物的分子结构的研究，指出Ⅱ型核酸内切酶，是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用，以EcoR Ⅰ为例，它是以同型二聚体上的6个氨基酸（每个亚基各有一个Glu和2个Arg残基），同识别序列上的嘌呤残基形成12个氢键的形式，而结合到靶DNA识别序列并从此发生链的切割反应。

§2.2 DNA连接酶

定义：能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，使两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNA ligase）。

目前已经知道有四种方法可以在体外将DNA片段连接起来：

a.用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来

b.用T4 DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来

c.先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用DNA连接酶将之连接起来。

d.先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，然后再用DNA

连接酶将之连接起来。

一、连接条件：

a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3 -末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链