第二章 基因工程中常用的工具酶
基因工程常用的工具酶
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
《生物技术概论》课程总复习
固定化酶 (细胞)的优点、固定化方法
酶分子的改造技术
酶反应器基本类型、生物传感器
酶工程的概念和基本过程（酶的分类）
*
第一节 酶的发酵生产
1
提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂
2
第三节 酶分子的改造
4
酶分子的修饰方法
5
第二节 酶的分离纯化
1
酶的制备技术(破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤 、浓缩、干燥);
杂合体的鉴别与ห้องสมุดไป่ตู้选
完全杂合、核质异源 酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定
*
2.3 人工种子 用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。
人工种子
解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题
*
制作过程
胚乳与褐藻酸钠混合后，加入胚状体，滴入到硝酸钙或CaCl2中， 2０分钟后，表面聚合，形成人工种子
03
*
重组子的筛选
筛选方法： 根据载体选择标记基因筛选
抗性筛选、蓝白斑筛选 gus 基因、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp， 根据报告基因筛选转化子 根据形成噬菌斑筛选转化子
*
重组子的鉴定
根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子
基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子
1
2
蛋白质组学（Proteomics）
“Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。
基因工程期末考试题及答案
基因工程期末考试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 纤维素酶B. 限制性内切酶C. 淀粉酶D. 过氧化氢酶答案：B2. 下列哪项不是基因工程的基本步骤？A. 目的基因的获取B. 基因的表达C. 基因的克隆D. 基因的测序答案：D3. 基因枪法是一种：A. 植物转基因方法B. 动物转基因方法C. 微生物转基因方法D. 所有生物的转基因方法答案：A4. 重组DNA技术中，通常使用哪种质粒作为载体？A. 质粒DNAB. 线粒体DNAC. 核糖体RNAD. 染色体DNA答案：A5. 基因工程中，目的基因的表达通常需要：A. 启动子B. 终止子C. 增强子D. 所有选项答案：D二、填空题（每空2分，共20分）1. 基因工程是指按照人们的意愿，将不同来源的基因在体外构建杂合DNA分子，然后导入到活细胞和生物体内，以改变生物的遗传特性并取得新品种或新产品。
2. 基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母菌和________。
答案：哺乳动物细胞3. 基因工程中，________是连接目的基因和载体DNA的关键酶。
答案：DNA连接酶4. 目的基因的表达需要________和________的协同作用。
答案：启动子；终止子5. 基因工程产品在医学领域的应用包括生产________、________和基因治疗等。
答案：重组蛋白；单克隆抗体三、简答题（每题10分，共30分）1. 请简述基因工程在农业中的应用。
答案：基因工程在农业中的应用主要包括提高作物的抗病性、抗虫性、抗旱性和提高作物的产量和品质。
例如，通过基因工程培育的抗虫棉可以减少农药的使用，提高棉花的产量和质量。
2. 基因工程在医学领域有哪些应用？答案：基因工程在医学领域的应用包括生产重组蛋白药物、单克隆抗体、基因治疗和疫苗开发等。
例如，利用基因工程技术生产的胰岛素可以治疗糖尿病，单克隆抗体用于治疗癌症和自身免疫性疾病。
3. 请解释什么是转基因生物，并简述其潜在的风险。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
江西生物科技题库及答案
江西生物科技题库及答案一、选择题1. 细胞是所有生物体的基本单位，以下哪项不是细胞的基本结构？A. 细胞膜B. 细胞核C. 线粒体D. 叶绿体答案：D2. 以下哪个选项是DNA的化学本质？A. 蛋白质B. 糖类C. 脂质D. 核酸答案：D3. 基因工程中常用的工具酶是：A. 淀粉酶B. 纤维素酶C. 限制性内切酶D. 过氧化氢酶答案：C4. 以下哪个不是生物体的遗传物质？A. DNAB. RNAC. 蛋白质D. 质粒答案：C5. 以下哪种生物技术不是基因工程？A. 转基因技术B. 细胞融合技术C. 组织培养技术D. 克隆技术答案：B二、填空题6. 细胞分裂过程中，______的复制和均分是遗传信息传递的关键。
答案：染色体7. 基因工程的基本原理是______原理。
答案：基因重组8. 酶在生物体内的催化作用具有______、______和高度的专一性。
答案：高效性、温和性9. 基因治疗是将正常基因导入到有缺陷基因的细胞中，以______或______缺陷基因的表达，达到治疗疾病的目的。
答案：修复、替换10. 植物组织培养技术中，脱分化和再分化是形成______的关键步骤。
答案：胚状体三、简答题11. 简述基因工程的应用领域。
答案：基因工程的应用领域包括农业（改良作物品质、抗病虫害）、医学（基因治疗、生产药物）、工业（生产酶、生物燃料）和环境保护（生物修复）等。
12. 描述PCR技术的原理及其在分子生物学研究中的重要性。
答案：PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增DNA片段的技术。
其原理是利用DNA聚合酶在特定温度下反复进行DNA的合成，通过多次循环，指数级增加目标DNA片段的数量。
PCR技术在分子生物学研究中具有重要性，因为它可以快速、高效地获得大量特定DNA 片段，用于基因克隆、序列分析、基因表达研究等。
四、论述题13. 论述转基因技术可能带来的伦理、环境和社会问题，并提出相应的解决策略。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
生物产业试题题库及答案
生物产业试题题库及答案一、选择题1. 生物产业是指利用生物资源，通过生物技术进行加工和开发，生产生物产品和提供生物服务的产业。
以下哪个选项不属于生物产业的范畴？A. 基因工程B. 石油化工B. 生物制药D. 生物农业答案：B2. 下列哪项技术不属于现代生物技术？A. 基因编辑B. 细胞培养C. 杂交育种D. 克隆技术答案：C3. 生物技术在农业中的应用包括以下哪项？A. 提高作物产量B. 改善作物品质C. 增强作物抗病虫能力D. 所有以上选项答案：D二、填空题4. 生物技术在医药领域的应用包括_________、_________和_________等。
答案：基因治疗、疫苗开发、药物生产5. 基因工程中常用的工具酶包括_________和_________。
答案：限制性内切酶、DNA连接酶三、简答题6. 简述生物技术在环境保护中的应用。
答案：生物技术在环境保护中的应用主要包括生物修复、生物降解和生物监测等。
生物修复是指利用微生物或植物的代谢活动来净化受污染的环境，如土壤和水体的修复。
生物降解是指利用生物体的代谢过程将有机污染物转化为无害或低毒的物质。
生物监测则是利用生物体对环境污染物的敏感性来检测环境的污染程度。
四、论述题7. 论述生物技术在食品工业中的应用及其对人类生活的影响。
答案：生物技术在食品工业中的应用十分广泛，包括食品添加剂的生产、功能性食品的开发、食品加工过程的优化等。
例如，利用酶技术可以提高食品加工的效率和产品质量；利用发酵技术可以生产出具有特定功能的益生菌食品。
这些应用不仅提高了食品的营养价值和安全性，也满足了人们对健康饮食的需求，对改善人类生活质量产生了积极的影响。
结束语：通过本题库的练习，考生可以对生物产业的基本概念、技术应用及其对社会的影响有一个全面的认识。
希望考生能够深入理解生物技术的潜力和挑战，为未来的生物产业发展做出贡献。
试论述基因工程的操作步骤和工具酶
试论述基因工程的操作步骤和工具酶下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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基因工程试题及答案
基因工程试题及答案# 基因工程试题及答案## 一、选择题1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 限制性内切酶B. DNA聚合酶C. 逆转录酶D. DNA连接酶2. 基因工程中，用于目的基因的克隆通常使用：A. 质粒B. 噬菌体C. 人工染色体D. 转座子3. 下列哪项不是基因工程的应用领域？A. 农业改良B. 疾病治疗C. 能源开发D. 武器制造## 二、填空题1. 基因工程中，常用的宿主细胞包括________、________和________。
2. 基因枪法是一种________技术，可以将目的基因直接导入植物细胞。
## 三、简答题1. 简述基因工程的基本操作步骤。
2. 基因工程在医药领域的应用有哪些？## 四、论述题1. 论述基因工程对现代农业的影响及其潜在风险。
## 参考答案### 一、选择题1. 答案：A, D。
限制性内切酶和DNA连接酶是基因工程中用于切割和连接DNA片段的常用工具酶。
2. 答案：A。
质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆和表达目的基因。
3. 答案：D。
基因工程的应用领域广泛，但武器制造不属于其应用范围。
### 二、填空题1. 答案：大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞。
这些是基因工程中常用的宿主细胞，用于表达外源基因。
2. 答案：基因转移。
基因枪法是一种基因转移技术，通过高速微粒子将DNA射入细胞内。
### 三、简答题1. 答案：基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、载体的选择与构建、目的基因与载体的连接、转化宿主细胞、筛选含有目的基因的细胞、目的基因的表达与检测。
2. 答案：基因工程在医药领域的应用包括：生产重组蛋白药物、基因治疗、疫苗开发、疾病诊断等。
### 四、论述题1. 答案：基因工程对现代农业的影响主要体现在作物改良、提高产量、增强抗病虫害能力等方面。
通过基因工程，可以培育出抗旱、抗盐碱、抗病的作物新品种，提高作物的适应性和产量。
然而，基因工程也存在潜在风险，如基因流可能导致非目标物种的基因改变，以及转基因作物对生态环境的影响等。
第二章--工具酶
3) 缓冲体系：限制性核酸内切酶要求有稳定的pH环境，这通常由 Tris•HCl缓冲体系来完成。另外保持限制性核酸内切酶稳定和活性一 般使用DTT。
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
影响限制性核酸内切酶活性的因素
4) 反应体积和甘油浓度：商品化的限制性核酸内切酶均加50％甘油作 为保护剂，一般在-20℃下贮藏。在进行酶切反应时，加酶的体积一般 不超过总反应的10％，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响 酶切反应。
II型
核酸内切酶和甲 基化酶分开 单一亚基 Mg2+
III型
双功能的酶 两种不同的亚基 ATP、Mg2+
特异性识别位点
切割位点 序列特异的切割 在基因工程中的应用
非对称序列
在距识别位点至少 1000bp的地方随机 的切割 不是 无用
回文对称结构
位于识别位点上 是 广泛使用
非对称序列
距识别位点下游 24～26bp处 是 用处不大
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
Klenow酶的基本用途
• 补平由核酸内切酶产生的5′粘性末端 • DNA片段的同位素末端标记 • cDNA第二链的合成 • 双脱氧末端终止法测定DNA序列
2010
湖南师范大学生命科学学院
基因工程
四、反转录酶
• 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链
5) 限制性核酸内切酶反应的时间：通常为1h，但大多数酶活性可维 持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。
6) DNA的纯度和结构：一个酶单位定义为在1h内完全酶解lμg λ噬 菌体DNA所需的酶量。DNA样品中所含蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均 会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是双链DNA， DNA的甲基化位置会影响酶切反应。
基因工程考研题库
基因工程考研题库基因工程是一种利用分子生物学技术，按照人们的意愿，将一种生物的基因转移到另一种生物体内，从而改变其遗传特性的技术。
它在农业、医学、工业和环保等领域都有广泛的应用。
下面，我们来探讨一些基因工程考研题库中可能会涉及的问题。
1. 基因工程的定义和基本原理基因工程，又称为DNA重组技术，是指通过人工手段将一种生物的基因导入到另一种生物的基因组中，使其获得新的遗传特性。
其基本原理包括：目的基因的获取、载体的构建、目的基因的导入、目的基因的表达和检测。
2. 基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶主要有限制性内切酶、连接酶和DNA聚合酶。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列并在特定位点切割DNA，连接酶可以将切割后的DNA片段连接起来，而DNA聚合酶则用于合成新的DNA 链。
3. 基因工程的载体基因工程中常用的载体有质粒、病毒载体和人工染色体。
质粒是细菌中常见的小型环状DNA分子，可以作为外源基因的载体；病毒载体则利用病毒的复制机制来传递基因；人工染色体则是通过人工构建的染色体结构来携带外源基因。
4. 目的基因的导入方法目的基因的导入方法主要有转化、转染和显微注射。
转化和转染通常用于微生物和植物细胞，而显微注射则常用于动物细胞。
5. 转基因生物的安全性问题转基因生物的安全性问题一直是公众关注的焦点。
这包括转基因生物对环境的潜在影响、对人类健康的潜在风险以及转基因产品在伦理和法律上的问题。
6. 基因治疗的原理和应用基因治疗是指将正常基因或经过修饰的基因导入到患者的细胞中，以治疗或预防疾病。
基因治疗在治疗遗传性疾病、癌症和某些病毒感染方面显示出巨大的潜力。
7. 基因工程在农业中的应用基因工程在农业中的应用主要体现在转基因作物的培育上。
通过基因工程，可以培育出抗病虫害、抗逆境、高产和品质优良的作物品种。
8. 基因工程在医学中的应用基因工程在医学中的应用包括生产重组蛋白药物、基因疫苗、基因诊断和基因治疗等。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
2基因工程-工具酶
4.DNA的分子结构： DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影 响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA量高出很多倍。 5.缓冲液：影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓 冲液。化学组成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：识别并切割特异的双链
DNA序列的一种内切核酸酶。[单位定义]在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合 物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写 第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字 母，小写 第4个字母代表株，小写 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制 酶的编号
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
以上序列中部分字母代表的碱基如下：
R=A或G；Y=C或T；M=A或C；K=G或T；S=C或G；W=A或T H=A或C或T；B=C或G或T；V=A或C或G；D=A或G或T；N=A或C或G或T
特性
限制和修饰活性 内切酶的蛋白结构 限制作用所需要的 辅助因子 宿主特异性识别 切割位点 酶催转换 DNA易位作用 甲基化作用的位点 识别未甲基化的序 列进行切割 序列特异的切割 基因工程中的用途
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
28
也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
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1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
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第二章基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一、限制修饰系统的种类（图）二、限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI—Escherichia coli RIHin dⅢ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
——远距离随机切割b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。
——远距离定点切割c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分子移动，因此是一种需要能量的过程。
——需要能量的反应d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，又具有甲基化酶活性。
——内切酶活性和甲基化酶活性四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点(1)基本特点：①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA分子形成链的断裂；——识别序列②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割部位③因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端④此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子A TP，但需加入Mg++离子，而且是从其识别序列内部切割DNA分子⑤在结构上是一种单一的成分，即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同，不具有多种亚基成分；(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。
绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶都能够识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
例如EcoRI识别的序列是GAA TTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。
呈典型的旋转对称型回文结构(3)平末端与粘性末端由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成——具平末端的DNA片段。
Blunt ends两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成——具粘性末端的DNA片段。
Cohesive ends粘性末端概念(定义)：（图）*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
(4)限制酶的识别序列与切割频率具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。
(5)同裂酶(isoschizomers)识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。
例如HpaI和MspI 就是一对同裂酶。
同裂酶形成同样的末端。
有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究DNA甲基化作用。
(6)同尾酶(isocaudamers)一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。
例如BamHI、BglⅡ、Sau3A等即是一组同尾酶。
BamHI GGA TCCBglⅡAGATCTSau3A GATC*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明：但产生的重组体中原识别位点发生了变化。
(7)识别多核苷酸序列的酶例如HindⅡ就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：5'-CTPyPuAC-3'其Py=嘧啶碱基C或T；Pu=表示嘌呤碱基A或G五、影响核酸内切酶活性的因素(1)DNA的分子特性a.限制酶识别位点周围的碱基成分b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。
c.完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性DNA需消耗更多的限制酶。
d.DNA的甲基化程度完全切割不同来源的DNA样品所需的限制酶单位（图）(2)酶切消化反应温度a.最适酶切消化温度不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。
酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活。
b.限制酶的星号活力限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变(变更)的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。
(3)DNA纯度酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性。
因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响六、核酸内切限制酶对DNA的消化作用应用X射线晶体学技术，测定限制酶－DNA复合物的分子结构的研究，指出Ⅱ型核酸内切酶，是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用，以EcoR Ⅰ为例，它是以同型二聚体上的6个氨基酸（每个亚基各有一个Glu和2个Arg残基），同识别序列上的嘌呤残基形成12个氢键的形式，而结合到靶DNA识别序列并从此发生链的切割反应。
§2.2 DNA连接酶定义：能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，使两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNA ligase）。
目前已经知道有四种方法可以在体外将DNA片段连接起来：a.用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来b.用T4 DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来c.先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用DNA连接酶将之连接起来。
d.先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，然后再用DNA连接酶将之连接起来。
一、连接条件：a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3 -末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链的5 -末端具有一个磷酸基团(P)，才能发挥其连接作用；b.由于在-OH和-P基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程(反应)，因此需要能源分子的存在才能实现连接反应。
在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是：NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]在动物细胞和噬菌体中，连接酶催化的连接能源是：A TP[腺苷三磷酸]二、最佳连接温度理论上连接酶体外最佳连接温度是37℃，但在此温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。
因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般经验认为是4～15℃比较合适。
三、DNA连接酶的反应条件（图）四、末端DNA片段的连接过程（图）§2.3 DNA 聚合酶常用聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、反转录酶等。
共同特点：都能够把将脱氧核糖核苷酸连续地加到引物链的3`-OH末端，催化核苷酸聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。
但大多数聚合能力差，参入不到10个核苷酸，就从引物模版解离下来：大肠杆菌DNA 聚合酶、Klenow酶、T4 DNA聚合酶。
参入数百个核苷酸：T7 DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ性质：5`－3`聚合酶活性；5`－3`外切酶活性；3` －5`外切酶活性聚合作用发生在引物链3`-OH末端同参入的核苷酸之间，当这个外源核苷酸参入之后，又提供一个新的3`－OH，因此，聚合酶催化的链的合成是按5`－3`方向生长当反应物中缺乏dNTPs，表现出3` －5`外切酶活性，将从游离的3`-OH末端逐渐的降解单链及双链DNA。
2.DNA缺口转移与探针的制备在分子克隆中的主要用途：通过缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA 探针。
原理：5`－3`外切酶活性从缺口的5`一侧移去一个5`核苷酸，聚合作用就在3`一侧补上一个新的核苷酸。
但是聚合酶不能够在3`-OH和5`-P之间形成键，因此随着反应的进行，5`-侧核苷酸被不断的移去，3`一侧核苷酸又按序的补加，于是缺口沿着DNA分子合成的方向移动。
——缺口转移探针制备（图）反应体系：特定的DNA；DNaseⅠ；PolⅠ；32P－dNTPs二、Klenow酶来源：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶，经枯草杆菌蛋白酶处理之后，产生出来分子量为76×103dal的大分子功能：5`-3`聚合酶活性；3`-5`外切酶活性用途：修补经限制酶消化形成的3`隐蔽末端标记DNA片段的末端cDNA克隆中的第二链cDNA的合成DNA序列测定缺点：不能够有效的标记带有3`突出的DNA末端。
同位素标记DNA片段的末端（图）三、T4 DNA聚合酶来源：T4噬菌体感染的大肠肝菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。
它是由噬菌体基因43编码T4 DNA聚合酶基本特征（图）3`-5`外切酶活性（图）取代合成法标记DNA片段（图）在没有dNTPs的情况下，3`外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能，它作用于双链DNA，并按3` －5`的方向从3`－OH末端开始降解DNA。
如果反应物中只有一种dNTPs，那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止，从而产生出具有一定长度的3`隐蔽末端DNA片段。
当反应物中加入标记的32P-dNTPs，这种局部消化的DNA片段便起到一种引物－模板的作用，T4 DNA 聚合酶的聚合作用超过了外切作用，反应物中32P-dNTPs逐渐取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有核苷酸——取代合成。
取代合成法制备探针的优点：不会出现人为的发夹结构（用缺口转移法制备的探针则会出现这种结构）应用适宜的核酸内切限制酶切割，他们便可以很容易地转变成特定序列的探针。