第一章微生物的分离和纯培养hw
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巴氏消毒法：70-75 ℃ 30min或80 ℃ 15min 化学药剂消毒法：酒精、氯气 紫外线消毒：实验前30min超净台
消毒方法
煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂（70%酒精等） 紫外线 灭菌方法
针对不耐高温的液体 接种室、超净工作台 接种工具（接种环等） 培养皿等玻璃器皿 实验操作者的双手 实验操作者的衣服 培养基
3、培养
将接种后的培养基和一个未接种的培养基，放 入37℃恒温箱中倒置培养12h-24h,直到长出菌落为 止。
4、实验结果观察
5、菌株的保存方法
搁置斜面 （1）临时保藏： 接种到固体斜面培养基，菌 落长成后置于4℃冰箱保存。 （2）长期保存： 甘油冷冻管藏法
六、微生物数量的计算
直接计数法
间接计数法
不加任何凝固剂，大规模工业生产及在 实验室进行微生物的基础理论和应用方 面的研究
按 用 途 不 同 划 分
基础培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营 养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）
选择培养基
用来将某种或某类微生物从混杂的微 生物群体中分离出来的培养基，在培 养基中加入相应的特殊营养物质或化 学物质，抑制不需要的微生物的生长， 有利于所需微生物的生长
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。
⑵稀释涂布平板法 a.梯度稀释菌液：
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
101
102
103
104
105
106
菌液
6支试管，分别加入9ml无菌水
b.涂布平板：
取0.1ml菌悬液
灼
微量 移液器
滴
涂
试
(3)稀释混合平板法（课本P14)
Pour plate
凝固剂
提供碳源、氮源、能源、生长因子
碳源、氮源、生长因子 无机盐 水、溶剂
H2O 定容至1000ml
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方
延伸：
选择培养基 应用
加入青霉素
加入高浓度食盐 不加氮源 不加含碳有机物的无碳 培养基 加入青霉素等抗生素
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离金黄色葡萄球菌 分离固氮菌 分离自养型微生物 分离导入了目的基因的 受体细胞
2、在_______ 火焰 旁 冷却接种环，并 打开棉塞
3、将试管口通过火焰
7、灼烧接种环，待其冷却后， 从第一区域划线的_______开 末端 始往第二区域内划线。重复以 上操作，在三、四、五区域内 划线。注意不要将最后一区的 划线与第一区相连。
冷却 的接种环 4、将已______ 伸入菌液中蘸取一环菌液
4.在倒平板的过程中，如果不小 心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与 皿底之间的培养基上滋生，因此最 好不要用这个平板培养微生物。
2、接种
⑴平板划线法
交叉划线法
连续划线法
1、将接种环放在 火焰上灼烧，直 烧红 到接种环_______
注： 只有一个稀释度，平均菌落数在30-300之间，以平均菌落数计算
原生动物
微生物的分离和纯培养技术是微生
物最基本的实验技术，它包括培养 基的制备、灭菌和消毒、接种、培 养等步骤
内容提要：
微生物及其分类
培养基与各类营养物质
无菌技术
菌落
大肠杆菌的纯化培养
微生物数量的测定
二、培养基 1、概念
人们按照微生物对营养物质的 不同需求，配制出供其生长繁殖的 营养基质。
鉴别培养基
wk.baidu.com
用于鉴别不同类型微生物的培养基， 微生物产生某种代谢产物，与培养基 中的特殊化学物质发生特定的化学反 应，产生明显的特征变化
3、基本营养
碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐 无机碳源： CO2、CO3 -、HCO3 ⑴碳源 有机碳源： 牛肉膏、蛋白胨等
2 -
自养微生物 异养微生物
＋、NO 无机氮源： NH 4 3 ⑵氮源 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
（1）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30-300个 菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10-100个菌落为宜。 （2）每个稀释度取3个平板平均值，同稀释度的三个重复 对照的菌落数不应相差很大。
（3）由10-4、10-5、10-6稀释度计算出的总活菌数也不能 相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
活菌数/ml＝ 同一稀释度3次重复菌落平均数 ×稀释倍数 培养菌类时所用的稀释液体积
多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低
1、操作步骤
编号 倾注平板 稀释菌样 恒温培养 吸取菌样 计数
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
原样
101
102
103
104
105
106
6支试管，分 别加入4.5ml 无菌水
0.2ml
0.2ml
0.2ml
104
105
106
2、计数原则
计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）
溶化
调pH(注意：灭菌前调PH) 分装、包扎 灭菌（高压蒸汽灭菌） 倒平板
倒平板技术
在火焰旁打开 锥形瓶 使瓶口迅速 通过火焰
1
2
打开一条稍大于 瓶口的缝隙，向培养皿 中倒入 约10-20ml倒入 培养皿，立即盖上皿盖。
3 4
等待平板冷却凝固 后倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃ 左右时，才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度？
2、分类
化学成分不恒定的天然有机物 按 成 分 不 同 划 分 天然培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁 培养基。用于工业生产
合成培养基
化学成分完全了解的物质配 制而成的培养基 高氏1号培养基、查氏培养 基。用于分类和鉴定
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使
其成为固体状态，琼脂含量一般为 按 物 理 状 态 不 同 划 分 1.5%-2.0%，固体培养基常用来进行微 固体培养基 半固体培养基 液体培养基 生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保 藏 琼脂含量一般为0.2%-0.7%，观察 微生物的运动特征、分类鉴定及 噬菌体效价滴定
三.无菌技术：
泛指在培养微生物的操作中， 防止外来杂菌的污染的方法
1.灭菌： 使用强烈的理化因素杀死物体内 外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
灼烧灭菌
干热灭菌箱
高压蒸汽灭菌锅
2、消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀 死物体表面或内部的部分微生物（不包 括芽孢和孢子）。
煮沸消毒法：100 ℃ 5-6min
计数室容积
计数室边长为1mm，则计数
区的面积为l×1＝1 mm2，盖 上盖玻片后计数室高度为 0.1mm，所以一个计数室的体 积为l×0.1＝0.1mm3。 (注意：1 ml ＝ 1000 mm3 )
2、操作步骤
1、稀释 用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。 2、镜检计数室 加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗， 95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。
灼烧法
干热灭菌
能耐高温的，需要保持干燥的物品
高压蒸汽灭菌
四、菌落
固体培养基上 1.定义： 单个 或少数菌体 大量繁殖 2.特征： 大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。 3.功能： 鉴定菌种的重要依据 子细胞群体
五、微生物的分离和纯培养
分散成单个细胞,形成单个菌落
1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（大肠杆菌分离和纯培养）
(3)能源 含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
（4）生长因子： 微生物生长不可缺少的微量有机物，如： 维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、 蛋白胨中含有）。
牛肉膏蛋白胨培养基 应用最广泛和最普通的细菌基础培养基
培养基组分 琼脂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 20g 5g 10g 5g 作用
8、将平板 倒置 放入培养 _____ 箱中培养。 5、将试管通过 火焰，并塞上棉 塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右 手将沾有菌种的接种环迅速伸入 三至五 平板内，划__________条平行线， 盖上皿盖。注意不要划破培养基。
为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养物。 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐 减少，以便得到菌落。
经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落， 即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出 现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。
优缺点：
能检测活菌数和杂菌数 时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响 由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所
以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更
5、清洗血球计数板 计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬 物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉 淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
3、计数方法
所统计的中格的总菌数A，菌液的稀释倍数为B，则1ml菌液中： (1) 25个中方格的计数板计算公式
总菌数
鉴别培养基:
加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基） 鉴别大肠杆菌 现象：蓝紫色金属光泽
4.培养基要满足微生物对环境条件的需求 ：
真菌 细菌 放线菌 微酸性（5.0-6.0） 中性（6.5-7.5） 微碱性（7.5-8.5）
pH： 温度：
大多数微生物适宜生长的温度在25-40℃之间
氧气： 厌氧菌需提供无氧条件
3、加样 取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取 少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区， 静置5min。 注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生
4、显微镜计数（以16小格 ×25中格的 规格为例） 在高倍下(40X)计数对两个计数室记数，方法：每个计数室选5 个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数，求得每个中 方格的平均值，再乘上25即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml 菌液中的总菌数。 注：依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体 一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜 计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值
(2) 16个中方格的计数板计算公式
A 25 10 4 B 50000 A B（个 / ml ） 5
A 16 10 4 B 40000 A B（个 / ml ） 4
总菌数
（二）间接计数法
——稀释平板计数法
将待测样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分 分散成单个细胞，取一定稀释度、一定量的稀释样液接种到平 板上，使其均匀分布于平板中的培养基内；或是将一定量的稀 释液，与溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，倾入无菌 培养皿中，摇匀、静置待凝。
1、血球计数板
计数板是一块特制的 厚玻璃片，玻片上有四个 槽构成三个平台，中央平 台又由一短槽隔成两半， 其上各刻有一小方格网。 每个方格网共分九个 大格，中央的一大格作为 计数用，称为计数室。
血球计数板计数室有两种刻度
* * # #
# * *
#
#
1大格=16中格 25×16=400小格
1大格=25中格 16 ×25 =400小格
可以用手触摸盛有培养基的锥 形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚 刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通 过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的 微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结 水珠，凝固后的培养基表面的湿 度也比较高，将平板倒置，既可 以使培养基表面的水分更好地挥 发，又可以防止皿盖上的水珠落 入培养基，造成污染。
（一）直接计数法
——显微镜直接计数法
将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放 在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微 生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用 于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。
优点：直观、快速、操作简单 缺点：
不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察
第一章 微生物培养技术
微生物:
1、特点
结构都相当简单，个体多数十分微小，通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有 的甚至没有细胞结构。
2、类群
病毒（无细胞结构、寄生生活）
细菌
电子显微镜下的结核杆菌
放线菌
真菌
青霉菌
酵母菌
原生生物
病 细
毒 菌
无细胞结构
2、类群
放线菌 真 菌
原核细胞
真核细胞
消毒方法
煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂（70%酒精等） 紫外线 灭菌方法
针对不耐高温的液体 接种室、超净工作台 接种工具（接种环等） 培养皿等玻璃器皿 实验操作者的双手 实验操作者的衣服 培养基
3、培养
将接种后的培养基和一个未接种的培养基，放 入37℃恒温箱中倒置培养12h-24h,直到长出菌落为 止。
4、实验结果观察
5、菌株的保存方法
搁置斜面 （1）临时保藏： 接种到固体斜面培养基，菌 落长成后置于4℃冰箱保存。 （2）长期保存： 甘油冷冻管藏法
六、微生物数量的计算
直接计数法
间接计数法
不加任何凝固剂，大规模工业生产及在 实验室进行微生物的基础理论和应用方 面的研究
按 用 途 不 同 划 分
基础培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营 养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）
选择培养基
用来将某种或某类微生物从混杂的微 生物群体中分离出来的培养基，在培 养基中加入相应的特殊营养物质或化 学物质，抑制不需要的微生物的生长， 有利于所需微生物的生长
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。
⑵稀释涂布平板法 a.梯度稀释菌液：
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
101
102
103
104
105
106
菌液
6支试管，分别加入9ml无菌水
b.涂布平板：
取0.1ml菌悬液
灼
微量 移液器
滴
涂
试
(3)稀释混合平板法（课本P14)
Pour plate
凝固剂
提供碳源、氮源、能源、生长因子
碳源、氮源、生长因子 无机盐 水、溶剂
H2O 定容至1000ml
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方
延伸：
选择培养基 应用
加入青霉素
加入高浓度食盐 不加氮源 不加含碳有机物的无碳 培养基 加入青霉素等抗生素
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离金黄色葡萄球菌 分离固氮菌 分离自养型微生物 分离导入了目的基因的 受体细胞
2、在_______ 火焰 旁 冷却接种环，并 打开棉塞
3、将试管口通过火焰
7、灼烧接种环，待其冷却后， 从第一区域划线的_______开 末端 始往第二区域内划线。重复以 上操作，在三、四、五区域内 划线。注意不要将最后一区的 划线与第一区相连。
冷却 的接种环 4、将已______ 伸入菌液中蘸取一环菌液
4.在倒平板的过程中，如果不小 心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与 皿底之间的培养基上滋生，因此最 好不要用这个平板培养微生物。
2、接种
⑴平板划线法
交叉划线法
连续划线法
1、将接种环放在 火焰上灼烧，直 烧红 到接种环_______
注： 只有一个稀释度，平均菌落数在30-300之间，以平均菌落数计算
原生动物
微生物的分离和纯培养技术是微生
物最基本的实验技术，它包括培养 基的制备、灭菌和消毒、接种、培 养等步骤
内容提要：
微生物及其分类
培养基与各类营养物质
无菌技术
菌落
大肠杆菌的纯化培养
微生物数量的测定
二、培养基 1、概念
人们按照微生物对营养物质的 不同需求，配制出供其生长繁殖的 营养基质。
鉴别培养基
wk.baidu.com
用于鉴别不同类型微生物的培养基， 微生物产生某种代谢产物，与培养基 中的特殊化学物质发生特定的化学反 应，产生明显的特征变化
3、基本营养
碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐 无机碳源： CO2、CO3 -、HCO3 ⑴碳源 有机碳源： 牛肉膏、蛋白胨等
2 -
自养微生物 异养微生物
＋、NO 无机氮源： NH 4 3 ⑵氮源 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
（1）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30-300个 菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10-100个菌落为宜。 （2）每个稀释度取3个平板平均值，同稀释度的三个重复 对照的菌落数不应相差很大。
（3）由10-4、10-5、10-6稀释度计算出的总活菌数也不能 相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
活菌数/ml＝ 同一稀释度3次重复菌落平均数 ×稀释倍数 培养菌类时所用的稀释液体积
多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低
1、操作步骤
编号 倾注平板 稀释菌样 恒温培养 吸取菌样 计数
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
原样
101
102
103
104
105
106
6支试管，分 别加入4.5ml 无菌水
0.2ml
0.2ml
0.2ml
104
105
106
2、计数原则
计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）
溶化
调pH(注意：灭菌前调PH) 分装、包扎 灭菌（高压蒸汽灭菌） 倒平板
倒平板技术
在火焰旁打开 锥形瓶 使瓶口迅速 通过火焰
1
2
打开一条稍大于 瓶口的缝隙，向培养皿 中倒入 约10-20ml倒入 培养皿，立即盖上皿盖。
3 4
等待平板冷却凝固 后倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃ 左右时，才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度？
2、分类
化学成分不恒定的天然有机物 按 成 分 不 同 划 分 天然培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁 培养基。用于工业生产
合成培养基
化学成分完全了解的物质配 制而成的培养基 高氏1号培养基、查氏培养 基。用于分类和鉴定
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使
其成为固体状态，琼脂含量一般为 按 物 理 状 态 不 同 划 分 1.5%-2.0%，固体培养基常用来进行微 固体培养基 半固体培养基 液体培养基 生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保 藏 琼脂含量一般为0.2%-0.7%，观察 微生物的运动特征、分类鉴定及 噬菌体效价滴定
三.无菌技术：
泛指在培养微生物的操作中， 防止外来杂菌的污染的方法
1.灭菌： 使用强烈的理化因素杀死物体内 外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
灼烧灭菌
干热灭菌箱
高压蒸汽灭菌锅
2、消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀 死物体表面或内部的部分微生物（不包 括芽孢和孢子）。
煮沸消毒法：100 ℃ 5-6min
计数室容积
计数室边长为1mm，则计数
区的面积为l×1＝1 mm2，盖 上盖玻片后计数室高度为 0.1mm，所以一个计数室的体 积为l×0.1＝0.1mm3。 (注意：1 ml ＝ 1000 mm3 )
2、操作步骤
1、稀释 用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。 2、镜检计数室 加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗， 95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。
灼烧法
干热灭菌
能耐高温的，需要保持干燥的物品
高压蒸汽灭菌
四、菌落
固体培养基上 1.定义： 单个 或少数菌体 大量繁殖 2.特征： 大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。 3.功能： 鉴定菌种的重要依据 子细胞群体
五、微生物的分离和纯培养
分散成单个细胞,形成单个菌落
1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（大肠杆菌分离和纯培养）
(3)能源 含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
（4）生长因子： 微生物生长不可缺少的微量有机物，如： 维生素、氨基酸、碱基等（牛肉膏、酵母膏、 蛋白胨中含有）。
牛肉膏蛋白胨培养基 应用最广泛和最普通的细菌基础培养基
培养基组分 琼脂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 20g 5g 10g 5g 作用
8、将平板 倒置 放入培养 _____ 箱中培养。 5、将试管通过 火焰，并塞上棉 塞
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右 手将沾有菌种的接种环迅速伸入 三至五 平板内，划__________条平行线， 盖上皿盖。注意不要划破培养基。
为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养物。 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划 线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐 减少，以便得到菌落。
经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落， 即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出 现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。
优缺点：
能检测活菌数和杂菌数 时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响 由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所
以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更
5、清洗血球计数板 计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬 物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉 淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
3、计数方法
所统计的中格的总菌数A，菌液的稀释倍数为B，则1ml菌液中： (1) 25个中方格的计数板计算公式
总菌数
鉴别培养基:
加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基） 鉴别大肠杆菌 现象：蓝紫色金属光泽
4.培养基要满足微生物对环境条件的需求 ：
真菌 细菌 放线菌 微酸性（5.0-6.0） 中性（6.5-7.5） 微碱性（7.5-8.5）
pH： 温度：
大多数微生物适宜生长的温度在25-40℃之间
氧气： 厌氧菌需提供无氧条件
3、加样 取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取 少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区， 静置5min。 注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生
4、显微镜计数（以16小格 ×25中格的 规格为例） 在高倍下(40X)计数对两个计数室记数，方法：每个计数室选5 个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数，求得每个中 方格的平均值，再乘上25即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml 菌液中的总菌数。 注：依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体 一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜 计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值
(2) 16个中方格的计数板计算公式
A 25 10 4 B 50000 A B（个 / ml ） 5
A 16 10 4 B 40000 A B（个 / ml ） 4
总菌数
（二）间接计数法
——稀释平板计数法
将待测样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分 分散成单个细胞，取一定稀释度、一定量的稀释样液接种到平 板上，使其均匀分布于平板中的培养基内；或是将一定量的稀 释液，与溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，倾入无菌 培养皿中，摇匀、静置待凝。
1、血球计数板
计数板是一块特制的 厚玻璃片，玻片上有四个 槽构成三个平台，中央平 台又由一短槽隔成两半， 其上各刻有一小方格网。 每个方格网共分九个 大格，中央的一大格作为 计数用，称为计数室。
血球计数板计数室有两种刻度
* * # #
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1大格=16中格 25×16=400小格
1大格=25中格 16 ×25 =400小格
可以用手触摸盛有培养基的锥 形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚 刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通 过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的 微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结 水珠，凝固后的培养基表面的湿 度也比较高，将平板倒置，既可 以使培养基表面的水分更好地挥 发，又可以防止皿盖上的水珠落 入培养基，造成污染。
（一）直接计数法
——显微镜直接计数法
将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放 在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微 生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用 于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。
优点：直观、快速、操作简单 缺点：
不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察
第一章 微生物培养技术
微生物:
1、特点
结构都相当简单，个体多数十分微小，通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有 的甚至没有细胞结构。
2、类群
病毒（无细胞结构、寄生生活）
细菌
电子显微镜下的结核杆菌
放线菌
真菌
青霉菌
酵母菌
原生生物
病 细
毒 菌
无细胞结构
2、类群
放线菌 真 菌
原核细胞
真核细胞