长效重组蛋白药物的研究进展

综述

长效重组蛋白药物的研究进展

中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):79～82

戚楠*马清钧

（军事医学科学院生物工程所北京100850）

摘要重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短，目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物分子量；2、利用血浆药物平衡；3、减少免疫原性。针对构建突变体、PEG化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法，及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。关键词长效重组蛋白药物半衰期分子量药物平衡免疫原性突变体PEG化血清白蛋白

中图分类号Q819

收稿日期：2005 12 23修回日期：2005 12 26

* 电子信箱：qinan_8@重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，临床上一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低，要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，不仅给患者带来不便，且易产生耐受性，耐药性及免疫原性等不良反应，因此临床上需要研制长效的重组蛋白药物。目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率。现将常用延长半衰期技术应用于重组蛋白药物的进展作一介绍。

1构建突变体通过构建突变体延长蛋白药物半衰期，常用方法有1、增加蛋白药物的糖基化程度，通过糖基化一方面在蛋白药物表面增加了侧链，增加蛋白质稳定性，阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用，另一方面使蛋白药物分子量增大，减少了肾小球滤过；2、通过形成缓释的微沉淀物，使释放游离型药物的时间延长。其已经研制成功并上市的药物如重组人EPO突变体（Amgen公司的Aranesp）和重组人胰岛素的突变体（Aventis公司的Lantus）。重组人EPO有3个N糖基化位点（asp24, asp38, asp83），1个O糖基化位点（Ser126）。重组人EPO的O糖基化与否与体内外活性及体内清除速率无关，而N糖基化不完全的重组人EPO体外活性正常，体内活性则降低到体外活性的1/500，且其体内清除率也明显加快。N 糖基化EPO对热和pH变化稳定，等电点PI为4.2～4.6，而未经糖基化EPO等电点PI为9.2［1,2］。由此可以看出，N糖基化对维持重组人EPO活性和减少体内清除率有重要作用，在此基础上构建了重组人EPO突变体Aranesp。Aranesp有165个氨基酸，采用定点突变技术，将其中5个氨基酸位点进行了改变，而与重组人EPO不同，即Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn和Pro90Thr，N连接的寡糖链从原来的3条增加到5条［3］，除asp24, asp38, asp83位点外，在30和88两个位点多了两个N连接寡糖链，从而使分子量从原来的30kDa增加到50kDa，在慢性肾衰病人中半衰期由原来的4~13h延长到平均49h［4］（27~89h）。

Lantus是从大肠杆菌 K12株表达的重组人胰岛素的突变体，在人胰岛素A链第21个位点将Asp突变成Gly；在B链碳端最后第30个位点加两个Arg，使胰岛素等电点PI由原来的pH4.0变为pH6.7。这种突变使其在酸性环境下为完全澄清溶液，一旦注入皮下组织（pH值提高）则因为等电点特性，变成不溶的微沉淀物［5］，可持续释放，最终进入血液，形成一平稳、

长时间、无尖峰的药物浓度曲线，趋近于正常生理胰岛素的基础分泌曲线。和重组人胰岛素皮下注射后4~8h的持续时间相比，体内浓度相对恒定24小时以上［6］，每天注射一次胰岛素即可。

2006, 26(2)戚楠等：长效重组蛋白药物的研究进展

中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006

2PEG化修饰PEG化（PEGylation），即聚乙二醇（polyethylene, PEG）共价修饰蛋白质。PEG化蛋白药物主要通过增加蛋白质的分子量，减少药物排泄，并且PEG可以作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇［7］，减少免疫原性，减少体内清除率，PEG的屏障作用还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解［8］，PEG化的这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。PEG化学修饰方法可分为两代，第一代PEG化使用分子量≤12kDa的PEG分子，第二代PEG 化采用分支的PEG［9］代替线性的PEG，增加偶联的PEG分子量，使偶联的PEG分子量达到60kDa［10］，并且增加偶联的PEG数目，使每个PEG化位点可以偶联两个PEG分子。第二代PEG化和第一代PEG化修饰相比，由于使用分支的PEG代替线性的PEG，减少蛋白酶和蛋白接触，在很大程度上减弱其水解作用；分支PEG对蛋白质屏蔽效应更为显著，使蛋白药物抗原性和免疫原性降低；更重要的是，随着偶联的PEG分子量的增大，体内清除率下降，血清半衰期得到了进一步的提高。

目前已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的L 天冬酰胺酶［11］（Enzon公司的Oncaspar）、PEG化的IFNα2b［12］（Schering公司的PEGIntron）、PEG化的IFNα2a［12］（Roche公司的Pegasys）和PEG化的G－CSF［14］（Amgen公司的Neulasta）。它们经PEG修饰后的特征，见表1：表1已上市的PEG化蛋白药物PEG修饰前后体内半衰期比较

Table.1 Comparison of half life of protein drugs in the market before modified and post modified by PEGylation

产品（商品名）平均分子量偶联的PEG

平均分子量未PEG化

的半衰期PEG化后的

半衰期公司PEG化的L－天冬酰胺酶（Oncaspar）143kDa5kDa20小时两周EnzonPEG化的IFN α2b （PEGIntron）31kDa12kDa4~12小时40小时

（22~60小时）ScheringPEG化的IFNα2a （Pegasys）60kDa40kDa5.1小时

（3.7~8.5小时）80小时

（50~140小时）RochePEG化的G CSF（Neulasta）39kDa20kDa3.5小时15~80小时Amgen 除了上述这些已上市的长效PEG化蛋白药物外，处于临床前研究的还有：超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、白介素 2（Ⅱ期，Chiron公司）、水蛭素（Ⅱ期，BASF AG公司）等，预计这些重组蛋白药物在上市之后都会有预期的长效。

3血清白蛋白融合人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是有585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量65kDa，它是人血浆中含量最高的蛋白质。HSA本身就是许多内源因子和外源药物的载体，药物和血清白蛋白结合后，可以减少其生物利用度同时增加在体内的半衰期［15］。大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短，而HSA有将近长达19天［16］的血清半衰期，并且HSA的基因在毕赤酵母中可以高效分泌表达，其发酵液表达量可以达到4g/L［17］，上清液杂质含量较少，纯化方便，因此将蛋白质药物基因与HSA 基因融合，在毕赤酵母或酿酒酵母中表达，获得HSA的融合蛋白，延长蛋白质药物的半衰期。美国马里兰州人类基因组科学（HGS）公司已经进行一系列与HSA融合延长蛋白质药物半衰期的研究，其蛋白质药物HSA /IFN α融合蛋白（Albuferon α）已完成Ⅱ期临床试验，正在研发的处于临床早期阶段的蛋白药物如HSA /IFN β融合蛋白（Albuferon β）、HSA/ rIL 2融合蛋白（Albuleukin）、HSA /rG CSF融合蛋白（Albugranin）、HSA /rHGH 融