血凝血凝抑制试验总结

1、如果是马上要做实验，先把实验所需的抗原、标准阳性血清、阴性血清、待检血清取出

回温，如果待检血清已冷藏，可取出放入37℃恒温培养箱中回温，待血清析出后取出（时间大约看具体情况而定）。

2、试验准备阶段：

a准备好清洗干净的血清离心管（要有刻度装血液）。

b采血：注射器内先加入一半体积的阿氏液（防止血液凝集，当所需红细胞较多时，加入注射器量程一半的阿氏液，当所需红细胞较少时，加入1.5 ml～2 ml的阿氏液）。

c 1%红细胞悬液的制备

采集至少3只SPF（无特定病原体）公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积的阿氏液混合，用PH 7.2、0.01 mol/L PBS液洗涤3次，每次去掉上层的清液后加入少量PBS用注射器反复抽吸使之混匀，再加至所要刻度，放入离心。每次均以1000 r/min离心10 min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%的红细胞悬液，4℃保存备用（实际PBS液用1%的生理盐水代替）。

d所需1%红细胞悬液的体积≥4 HAU+1 ml（本例中为30 ml+1 ml=31 ml），否则配置的1%红细胞悬液不够用（理论计算为30.1 ml，取31 ml以防万一）。

e阿氏液（Alsevers）制备

葡萄糖 2.05 g

柠檬酸钠0.80 g

柠檬酸0.055g

氯化钠0.42 g

加蒸馏水至100 ml，散热溶解后调PH值至6.1, 69 kPa高压灭菌15 min，4℃保存备用。

3、血凝试验

目的：检测试验所用的标准抗原的血凝滴度，如检测结果血凝滴度为210 = 1024，表示标准抗原稀释1024倍仍能与红细胞发生凝集反应。

注意：

一瓶新的未使用的抗原（禽流感或新城疫为粉状），需要加入（用注射器）2ml的稀释液（0.9%生理盐水，一般瓶身上有标注加入的体积2ml）

a反应板要同时做三排（每排12孔），原因：根据三排的多数结果来确定血凝滴度。例如：三个结果为：210、29、29，则本次试验标准抗原血凝滴度为29。

b加入1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合1min，室温20℃～25℃下静置40 min，放4℃静置60 min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。

4、4 HAU抗原

例如：标准抗原血凝滴度为210 = 1024，则4 HAU抗原=（1：210）/4 = 1：256，稀释时，将1 ml的抗原加入到255 ml的PBS中即为4 HAU。

5、计算配置4 HAU所需稀释液体积V和标准抗原体积X

假设：待检血清100份每排12个孔（实际只需要11孔，但多计算一些，以防不够）每孔加入25 ul 4 HAU抗原体积= 25 ul×12×100 = 30000 ul = 30 ml

设标准抗原体积为X

则有： 1 ：256 = X ：30000

标准抗原体积X = 3000 / 256 = 117.1875 ul =0.117 ml

稀释液体积V = 30 - 0.117 = 29.883 ml

但实际量取时稀释液体积直接用30ml计算，因为0.117 ml数量很小，可以忽略不计。

6、血凝抑制试验

a红细胞在使用过程中应经常摇匀。

b加入1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合1min，室温20℃～25℃下静置40 min，若环境温度过高，放4℃静置60 min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。

7、结果判定

血凝试验：将反应板倾斜，看是否呈泪滴状，不呈泪滴状的说明发生血凝

血凝抑制：将反应板倾斜，看是否呈泪滴状，呈泪滴状的说明未发生血凝或血凝不完全即血凝抑制

8、