溶菌酶的晶体培养试验

溶菌酶晶体培养实验

一．实验目的

近年来，X射线晶体结构分析技术在受体研究中得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养实验：1．了解蛋白质分子结晶的原理

2．了解影响蛋白质分子结晶的因素

3．掌握蛋白质晶体的悬滴培养法

二．蛋白质分子结晶的原理

蛋白质结晶的4个主要步骤：

1．测定蛋白质溶液的纯度

2．蛋白质溶液与盐，有机化合物等沉淀剂混匀；膜蛋白需要加入去垢剂3．混合溶液达到过饱和状态，形成晶核

4．晶核一旦形成，晶体开始生长

三．影响蛋白质分子结晶的因素

1．待结晶蛋白质的纯度，一般要求纯度高于95%

2．待结晶蛋白质的浓度，5~10 mg/ml

3．沉淀剂，盐，PEG，有机溶剂

4．pH值

5．温度，4°C, 16°C

6. 结晶方法，悬滴法，坐滴法

7．震动

四．试剂及器材

1．试剂：溶菌酶蛋白，氯化钠，醋酸钠，去离子水

2．器材：可调移液器，晶体培养板，硅化盖玻片，真空脂，晶体培养箱，显微镜

五．试验步骤

1．配制50 mg/ml 溶菌酶溶液，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5

2．配制池液：（1）5% (w/v) 氯化钠，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5

（2）8% (w/v) 氯化钠，0.1 M醋酸钠溶液，pH4.5 3．在晶体培养板溶剂池中分别加入0.3 ml池液（1）和池液（2）

4．在干净的硅化盖玻片上，滴加2 ml溶菌酶溶液和2 ml池液

5．将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池上，用真空脂密封

6．将晶体培养板放入16°C晶体培养箱

7．第二天，在显微镜下观察晶体生长情况

Procedure for Crystallization of Lysozyme Chemicals needed:

Lysozyme protein

Sodium Chloride

Sodium Acetate buffer

Distilled water

Procedure

1.Prepare 50 mg/ml sample of lysozyme in 0.1 M NaAc pH4.5

2.Prepare well solutions:

a. 5% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5

b. 8% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5

3. Place 0.3 ml of well solution a, well solution b in each well of a VDX tray

4. On a clean silated cover slide, create 4 drops of 2 μl lysozyme solution, 2 μl well solution

5. Seal these cover slips with grease over a well

6. Place the VDX plate in 16 °C incubator.

7. Observe the crystals next day under microscope