重组质粒DNA的提取及酶切鉴定

实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定

【实验原理】

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。

对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。

【实验步骤】

本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。

1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。

2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。

3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。

4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。

5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。

6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。

7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。

8. 重复上一步，

9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。

10. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。

11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。

在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）

ddH2O 9μL

10×Green Buffer 2μL

EcoR I 0.5μL

Pst I 0.5μL

重组质粒8μL

12.限制性内切酶最后加入，混匀。37℃水浴温育10 min。跑胶时直接上样。

【结果与分析】

1 2 3 4

如图所示，1、2、3、4号是本组实验结果，1号和3号泳道是重组质粒PCR电泳，由于重组质粒PCR比较成功，因此出现清晰明亮的条带。2号和4号泳道为酶切质粒电泳，因为质粒酶切成功，所以看到条带清晰。但是重组质粒PCR电泳条带出现拖尾现象，说明重组质粒有污染。4号电泳带的酶切质粒上部出现两个快要连接的条带，说明部分质粒酶切不完全。