重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
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实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
【实验原理】
分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA,十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4~8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同,分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶(切割位置在识别序列内部)。
对质粒进行酶切,通过跑胶观察片段大小,从而鉴定质粒。
【实验步骤】
本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒,操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL),12000rpm离心1min ,弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中,12,000rpm离心1min,弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ(P1),vortex。
4. 加250 solution Ⅱ(P2),上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注:此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ(P3),立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中,尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ,弃收集管中的液体。注:此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液(PW)于离心吸附柱中,12000rpm离心1min ,倒掉废液。
8. 重复上一步,
9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中,在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中,12,000 rpm离心30 sec,弃滤液。
10. 滴加50ul elution buffer(EB)至膜中央,室温放置2min后,12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。
11.构建重组质粒酶切体系,限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。
在冰浴上建立酶切反应体系(20 μl)
ddH2O 9μL
10×Green Buffer 2μL
EcoR I 0.5μL
Pst I 0.5μL
重组质粒8μL
12.限制性内切酶最后加入,混匀。37℃水浴温育10 min。跑胶时直接上样。
【结果与分析】
1 2 3 4
如图所示,1、2、3、4号是本组实验结果,1号和3号泳道是重组质粒PCR电泳,由于重组质粒PCR比较成功,因此出现清晰明亮的条带。2号和4号泳道为酶切质粒电泳,因为质粒酶切成功,所以看到条带清晰。但是重组质粒PCR电泳条带出现拖尾现象,说明重组质粒有污染。4号电泳带的酶切质粒上部出现两个快要连接的条带,说明部分质粒酶切不完全。