酶活性的检测方法
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expans um孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用P E塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100m L 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100m g 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
端粒酶活性的检测方法探索
端粒酶活性的检测方法探索端粒酶是一类重要的酶，参与维持染色体稳定性和基因组完整性的功能。
它能够在染色体末端的端粒上加上重复序列，减缓染色体的缩短和衰老过程。
如何准确检测端粒酶活性一直是科学家们关注的研究领域。
本文将探索端粒酶活性的检测方法，以期为相关研究提供参考。
一、端粒酶活性检测方法一：荧光探针法荧光探针法是一种常用的端粒酶活性检测方法。
通过在特定条件下，在待测物中加入有机荧光探针，探针与端粒酶发生作用，从而发出特定的荧光信号。
这种方法基于对荧光信号的监测，能够间接地反映端粒酶的活性水平。
二、端粒酶活性检测方法二：聚合酶链反应法聚合酶链反应法（PCR）是一种常用的DNA扩增技术，也可以用于测定端粒酶活性。
该方法基于端粒酶对模板DNA进行延伸，通过PCR扩增得到的产物进行分析，进而检测端粒酶的活性。
三、端粒酶活性检测方法三：细胞培养法细胞培养法是一种直接检测端粒酶活性的方法。
研究人员通过将待测样本细胞转染至全新培养基中，利用培养过程中对细胞进行观察和分析，评估端粒酶活性的水平。
四、端粒酶活性检测方法四：质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于检测端粒酶活性。
通过质谱仪对待测样本进行分析，能够获得准确的质谱图谱，从而判断端粒酶活性的高低。
该方法具有非常高的分析精确度和灵敏度。
五、端粒酶活性检测方法五：电泳法电泳法常用于检测DNA分子的长度和限制性内切酶剪切位点。
端粒酶活性检测也可以借助电泳技术进行。
使用特定试剂对待测物进行限制性内切，然后利用电泳仪进行分析，通过分析DNA片段的长度和数量变化，来推测端粒酶的活性。
六、总结与展望端粒酶活性的准确检测对于揭示细胞衰老、肿瘤等疾病的发生机制以及判断药物的疗效具有重要意义。
本文介绍了荧光探针法、聚合酶链反应法、细胞培养法、质谱法和电泳法等常用的端粒酶活性检测方法。
随着科学技术的不断进步，我们相信将会有更多更准确的方法被开发和应用于端粒酶活性的检测。
这些方法的发展有望为研究人员提供更深入的了解端粒酶活性的机制以及其在疾病治疗中的应用提供更强有力的证据。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法通常包括以下几种常见的技术：
1. 吸收光谱法：利用酶底物与产物在不同波长下的吸光度差异，通过光谱仪测量反应过程中的吸光度变化来检测酶的活性。
2. 色谱法：利用色谱仪对酶底物和产物进行定量分析，可测定酶催化反应中底物和产物的浓度变化，从而确定酶的活性。
3. 比色法：利用对比试剂和酶底物反应后产生的色素溶液颜色深浅的变化来测定酶的活性。
比色法一般适用于检测酶对底物的催化活性。
4. 酶标测定法：利用酶对底物的特异性催化作用来标记或测定其他物质的方法，包括酶联免疫吸附分析（ELISA）和酶标记免疫测定法等。
以上是一些常见的酶活性检测方法，具体的选择取决于酶的特性和所需测定的参数。
值得注意的是，不同酶可能需要不同的检测方法，并且在进行实验时应根据实际情况选择合适的检测方法。
测定酶活性的方法
测定酶活性的方法
测定酶活性的常用方法有以下几种：
1. 吸光测定法：利用酶催化底物反应产生的产物对特定波长的光的吸收变化进行测定，常见的方法有比色法和荧光法。
2. 浊度测定法：在酶催化底物反应中，产生的沉淀、胶束或团聚物等形成浑浊或沉淀，通过测定反应溶液的浊度变化来确定酶活性。
3. 冷凝法：利用酶催化底物反应产生的产物，通过与特定试剂发生反应产生气体或形成沉淀，在特定条件下进行冷凝，并通过测定冷凝物的质量或体积变化来确定酶活性。
4. 离子选择性电极法：利用通过酶催化底物反应产生或消耗的离子浓度变化，通过检测特定离子选择性电极反应电位的变化来测定酶活性。
5. 标记物测定法：将底物或产物标记上特定的分子或放射性核素，通过测定标记物在反应中的变化来测定酶活性，如放射性测定法、荧光标记物测定法等。
这些方法根据不同的实验要求和酶的特性可以选择不同的测定方法来进行酶活性的测定。
体外酶活检验实验方法
体外酶活检验实验方法说实话体外酶活检验实验方法这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过很多方法，最开始的时候，我都搞不清楚到底要怎么准确测量酶活。
比如说，我就知道酶能催化反应，但是怎么通过这个来判断酶活性高低呢？我那时候就很天真地想，只要看到反应发生了，不就说明酶有活性吗？这可大错特错了。
我做了一个超级简单的实验，弄点酶和底物放一起，看到有点反应，就觉得自己测出酶活了。
结果拿给懂行的人看，人家一下就指出问题了。
这告诉我，判断反应的发生可不是这么随便的事儿，得有个定量的方式。
后来我就知道我们得看底物的减少量或者产物的生成量。
测量这个其实就像数树上的果子一样，要一个一个地数清楚。
比如说对于可以产生颜色变化产物的反应，我们就可以通过检测吸光度来确定产物的量。
但这里头也有讲究。
我第一次做这个检测吸光度的时候，用的仪器没校准好，得到的数据乱七八糟的。
这就好比你拿一把没刻度的尺子量东西一样，测出来的结果肯定不准。
校准仪器很重要。
再说说反应体系的构建。
你得给酶创造一个舒适的小环境，这就像给小动物建一个合适的窝一样。
这个体系里面必须包含酶、底物，还得有合适的缓冲液。
这个缓冲液就像空调一样，可以调节反应体系的温度和酸碱度，让酶处在一个最适合干活儿的状态。
可别小看这个缓冲液，我一开始觉得随便弄点进去就行了。
有一次我就没调好酸碱度，结果酶活低得离谱。
还有这反应的温度和反应时间得掌控好。
温度就像厨师做菜的火候，太热或者太冷，酶这道菜就做不好了。
我之前试过把反应体系放在温度有点高的地方，结果酶失活了，反应根本就没按照预期进行。
而反应时间呢，时间短了反应不完全，可能你测到的酶活就比实际的低，时间太长了，又有可能会有一些副反应发生，也会影响结果的准确性。
我通常会先做一些预实验，就像先试吃一小口菜，感觉下这个大概的时间和温度范围。
比如说我慢慢调整温度，从低温到高温，发现这个酶在某个温度区域活性最高。
至于反应时间，我会先做个大概的估计，等反应一段时间后，抽样检测下，看看产物的量有没有达到一个稳定的值，如果还在变化，就说明还得再等等。
测土壤酶活方法
测土壤酶活方法酶活性是评价土壤质量和生物活性的重要指标之一。
测定土壤酶活性可以帮助我们了解土壤中微生物的活动水平和土壤中有机物的分解能力，从而判断土壤的肥力和健康状况。
本文将介绍几种常用的测土壤酶活性的方法。
一、脲酶法测定土壤酶活性脲酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中脲酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
脲酶是一种催化尿素分解的酶，可以将尿素分解为氨和二氧化碳。
测定土壤中脲酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
脲酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有尿素和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的尿素，计算出脲酶的活性。
二、过氧化氢酶法测定土壤酶活性过氧化氢酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中过氧化氢酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可以将过氧化氢分解为水和氧气。
测定土壤中过氧化氢酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
过氧化氢酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有过氧化氢和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的过氧化氢，计算出过氧化氢酶的活性。
三、醋酸红法测定土壤酶活性醋酸红法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中醋酸红酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
醋酸红酶是一种催化醋酸红分解的酶，可以将醋酸红分解为醋酸和二氧化碳。
测定土壤中醋酸红酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
醋酸红法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有醋酸红和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的醋酸红，计算出醋酸红酶的活性。
测定土壤酶活性可以通过脲酶法、过氧化氢酶法和醋酸红法等方法来进行。
酶活实验方法详细
一．EROD活性检测方法（1）暴污：在2 mL离心管中加入300 mL污染物样品，再加入300 mL稀释2倍的粗酶液（即原酶液用pH为7.4的PBS稀释2倍），漩涡振荡器上快速混匀，常温下孵育1 h。
（2）活性检测：在上述暴污后的酶液中加入0.2 mmol/L的ERF（乙氧基试卤灵）30 μL，漩涡振荡器上混匀，置于35摄氏度水浴中孵育10 min后，再加入0.25 mmol/L的NADPH 120μL，漩涡振荡器上快速混匀并尽快将其加入酶标板中测值，加酶标板时205μL/孔。
（3）荧光测量条件：Ex=532nm，Em=580nm；使用动力学方法，每隔30s测一次值，共10min，取斜率值时取前5 min钟。
注意事项：1、NADPH用无钙镁离子的pH=7.4的PBS溶液作溶剂配置。
2、ERF无论是配置还是稀释时均用DMSO作溶剂，不可用水或PBS稀释，否则会导致反应变慢，线性变差。
3、ERF的浓度对反应贡献最大，加样时特别注意ERF量的一致性。
二．GST活性检测方法（1）暴污：在2 mL离心管中加入40 μL污染物样品，再加入40 μL稀释25倍的粗酶液（即原酶液用pH为7.4的PBS稀释25倍），漩涡振荡器上混匀，常温下孵育1 h。
（2）活性检测：在上述暴污后的酶液中加入pH为6.5的PBS 缓冲液720 μL，再30 mmol/L 的GSH（谷胱甘肽）40 μL，漩涡振荡器上快速混匀后，立即加入30 mmol/L的CDNB 40μL，漩涡振荡器上快速混匀并尽快将其加入酶标板中测OD值，加酶标板时200μL/孔。
（3）OD值测量条件：使用动力学方法，340nm下测OD值，每隔30s测一次值，共5min。
注意事项：1、酶液的稀释倍数以未经暴污的酶液催化的反应是非酶促反应的5-7倍为准（原酶液活性随时间会有变化，因此稀释时需要注意调整倍数）。
2、GSH溶剂为超纯水，CDNB溶剂为无水乙醇。
3、非酶促反应不加酶，但是为了保证最终总量与样品一致，pH为6.5的PBS缓冲液多加80μL其他加样与样品组一致。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
临床生物化学检验-第8章 连续监测法测定酶活性
(amylase, AMY)
1. 以天然淀粉为底物的测定方法：可测定淀粉水解前后粘度或浊度的改变；也可测产物葡 萄糖；还可测定淀粉与某些活性染料的呈色反应（如碘淀粉比色法 ，但准确性和重复性都 较差）。
2. 以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法：底物的结构和相对分子量确定。
IFCC推荐法： EPS法：以4,6-亚乙基-4-硝基酚-“-D-麦芽七糖苷 (EPS) 做底物偶联多功能“-葡萄糖糖苷酶
9
“-
(alpha-L-fucosidase,AFU)
1. 以4-甲基伞形酮-“-L-岩藻糖苷为底物的荧光法： 灵敏度高 ，但需先用凝胶去除干扰物质。 2. PNPF法：以4-硝基苯-“-L-岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放4-硝基苯酚后 ，用碱性缓 冲液终止反应 ，使4-NP呈黄色的方法：需设样本空白并延长反应时间。
12
N-
(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAG)
1. CNP-NAG法： 色原CNP解离常数 (PKa) 为 5.5 ，摩尔吸光系数大 ，可实现NAG的速 率法分析 ，无需设置样品空白 ，但底物的溶解性和稳定性较差。
2. PNP-NAG法：底物易得 ，反应速度快且稳定 ，是目前常用的方法。 3. MTP-NAG法：可用于尿液NAG测定 ，底物稳定 ，反应灵敏度高。
3. 连续监测法： CNP-NAG法、 PNP-NAG法、 MTP-NAG法。
测定原理： CNP-NAG NAG CNP + 氨基葡萄糖苷
PNP-NAG NAG PNP + 氨基葡萄糖苷
产物CNP、 MPT在405nm/ 340nm处的吸光度与NAG 的活性成正比。
MTP-NAG + H2O NAG N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖+ MPT (6- 甲基-2-巯基吡啶
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。
酶活性测定方法
酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm 下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定可是个超级重要的事儿呢！就好像我们要了解一个运动员有多厉害，得看他在赛场上的表现一样。
那怎么去测定酶活力呢？嘿，方法可多啦！
一种常见的方法就是比色法。
这就好比我们通过观察颜色的变化来判断事情的进展。
通过特定的化学反应，让酶和底物作用，然后产生一些有颜色变化的物质，我们根据颜色的深浅来衡量酶活力的高低。
你说神奇不神奇？
还有一种是荧光法，哇哦，这就像是在黑暗中找到那闪闪发光的宝贝。
利用酶反应会引起荧光强度的变化，从而准确地知道酶活力的大小。
再说说同位素测定法，这可有点高科技的味道了呢！就如同有个超级侦探在追踪着微小的线索。
通过标记同位素，然后观察它们的变化，来确定酶活力。
另外，电化学法也不能小瞧呀！它就如同一个敏锐的传感器，能精确地捕捉到微小的电信号变化，进而反映出酶活力的情况。
这些方法各有各的奇妙之处，各有各的用处。
我们可以根据不同的酶、不同的实验条件去选择最合适的方法。
难道不是吗？
酶活力测定在生物、医学、化学等领域都有着至关重要的地位。
它就像是打开一扇门的钥匙，让我们能深入了解那些神奇的生物化学反应。
没有准确的酶活力测定，我们怎么能更好地研究疾病的发生机制？怎么能研发出更有效的药物？怎么能推动科学的进步呢？
所以啊，我们一定要重视酶活力测定，不断探索和改进测定的方法。
让我们能像超级英雄一样，揭开酶的神秘面纱，为人类的健康和科学的发展贡献自己的力量！这是多么有意义的事情啊！。
酶检测方法
酶检测方法酶是生物体内一类具有特定功能的蛋白质，它们在生物体内发挥着关键的催化作用。
酶的活性能够反映生物体内代谢的运行状态，因此酶检测在生物学研究、临床诊断和生物工程等领域起着重要的作用。
本文将介绍酶检测的方法，并分析其原理和应用。
一、酶检测的原理每种酶都具有特定的底物，当底物被酶催化后产生一定的产物，可以通过测量产物的数量或者相关反应的速率来间接反映出酶的活性。
酶的检测方法主要有光度法、荧光法、比色法和电化学法等。
光度法是利用酶催化反应后产生的物质溶液的吸收特性来检测酶活性的方法。
首先，选择具有特定光学属性的底物，使酶催化后的产物能够吸收特定波长的光线。
然后，通过测量反应体系中吸光度的变化来确定酶的活性。
举例：以辣根过氧化物酶的检测为例，辣根过氧化物酶能够将辣根过氧化物（HRP）和底物间的过氧化氢催化成高活性的自由基，进而氧化显色底物，形成有色产物。
利用比色法测定产物的吸光度变化，即可定量检测出辣根过氧化物酶的活性。
荧光法是利用酶催化反应产物的荧光特性来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，有些底物和产物具有荧光特性，通过测量产物的荧光强度变化可以确定酶的活性。
举例：以葡萄糖氧化酶的检测为例，葡萄糖氧化酶能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，产生荧光物质NADH。
通过测量NADH的荧光强度变化，可以判断葡萄糖氧化酶的活性。
比色法是利用酶催化反应后产生的有色产物来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，底物与其他试剂反应产生有色产物，通过测量产物的吸光度变化来确定酶的活性。
举例：以碱性磷酸酶的检测为例，碱性磷酸酶能够将对硝基苯磷酸钠底物催化成黄色产物对硝基苯胺。
通过测量对硝基苯胺的吸光度变化，可以确定碱性磷酸酶的活性。
五、电化学法电化学法是利用酶在电极表面催化产生电流来检测酶活性的方法。
在电极表面固定酶，底物被酶催化后，产生电荷转移，可以通过测量电流变化来确定酶的活性。
举例：以谷胱甘肽还原酶的检测为例，谷胱甘肽还原酶能够将还原型谷胱甘肽（GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
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DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
葡萄糖醛酸酶(GUS)
酶活性的检测方法
（四） 电极检测法
淀粉酶的活性检测
Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 240-245