第八章 酶定向进化

二突变基因的筛选
• （一）定向选择环境条件的设定 • （1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一 次突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养 温度。 • （2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的 活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性， 可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素 的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛 选循环中逐步提高抗生素的浓度。 • （二）高通量筛选技术P217表8－2
天然酶的局限
• 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.
现代生物工程的要求
• 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底 物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物 的原材料 • 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造 或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应 用前景.
基因重组
在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体连接在一起形成重组DNA的技术过程。 黏性末端连接 平头末端连接 修饰末端连接
形成基因文库
将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活 性的噬菌体的过程。 重组质粒载体：转化 重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋 白将重组DNA进行包装，称为有感染活性 的重组噬菌体，而形成基因文库。
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天然酶的应用
• 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转 化,已成为生产精细化学品,手性药物,食品添 加剂等的重要工具,获得了广泛应用. 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的 逐步深入,研究者发现,酶催化的精确性和有 效性常常不能很好地满足酶学研究和工业 化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性 低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催 化功能
• 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件， 增加碱基配对错误的出现频率，就成为易 错PCR技术。 • 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度 的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、 dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使 DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基 配对错误的出现频率，而引起基因突变。
酶定向进化的特点
1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著
第二节 酶基因的随机突变
• 体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重 排技术、基因家族重排技术 • 基因随机突变方法的特点P207表8－1 • 随机突变方法可以联合使用，交叉进行， 通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的 定向进化。
一 易错PCR技术
• 2）随机引物体外重组技术 • 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板 不同部分的序列互补DNA小片断，然后除 去模板，这些DNA小片断互为模板和引物 进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获 得全长突变基因。
三基因家族重排技术
• 概念 • 又称为基因家族改组技术，是从基因家族 的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
酶定向进化的基本过程
• 随机突变、构建突变基因文库、定向选择 • 酶定向进化的基本过程：
酶基因
随机突变 反复进行
构建突变基因文库 筛选 正突变基因 进化酶
负突变基因
• 随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种 简化的DNA shuffling 技术 基因家族重排技术 •
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定向进 化的过程。 • 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或 者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在 体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家 族重排等技术进行人工突变，然后进行定 向选择而获得所需突变体。
酶分子定向进化
• 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程 （随机突变和自然选择），在体外进行酶 基因的人工随机突变，建立突变基因文库， 在人工控制条件的特殊环境下，定向选择 得到具有优良催化特征的酶的突变体的技 术过程。
特点
• 正突变的概率低，突变基因文库较大，文 库筛选的工作量大，一般适用于较小基因 的定向进化。
二 DNA重排技术
• 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变 基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切 割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
（二）构建突变基因文库的主要过程
• 载体的选择 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链 DNA分子。 2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具 有自我复制能力的载体。 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性 末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单 链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因 载体。
思考题
1 何谓酶的定向进化？有何特点？
2 酶基因随机突变的三种方法？ 3 易错PCR技术的概念及其主要过程。 4 DNA重排技术的概念及其主要过程。 5 基因家族重排技术及其主要过程。
第三节 酶突变基因的定向选择
• 突变基因的定向选择基本过程
突变基因 基因载体
基因重组 突变基因文库
筛选 目的基因
一 酶突变基因文库的构建
• （一）构建基因文库的质量要求 • 1 文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地 包含基因的任何一种可能的突变信息。 • 2 文库的完整性：指文库中包含的DNA片 断必须尽可能完整地反应基因的结构和功 能信息，以便通过筛选得到的突变基因能 够通过表达获得完整的具有催化功能的进 化酶。
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
定向进化
• 定向进化是模拟自然进化的过程，进行人 工随机突变，并在特定的环境条件下进行 选择，使进化朝着人们所需要的方向发展 的技术过程。 • 分为分子定向进化和细胞定向进化
细胞定向进化
第八章 酶定向进化
• 天然酶的应用及局限性 酶的定向进化的思想 酶的定向进化的策略和方法 酶的定向进化技术的展望
• 生物体系之所以能够相对独立地存在于自 然界中,并维持其独立性和生命的延续性,都 是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用. 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生 化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺 利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶 的作用紧密相关,可以这样说,没有酶的存在, 就没有生物体的一切生命活动.
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变基因
基因重组
构建突变基因文库 负突变基因
（反复进行）
筛选
正突变基因
进化酶
• DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧 核糖核算酶Ⅰ（DNase Ⅰ)等酶的作用，随机切割 成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引 物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机 片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适 宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。 • 这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA 随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序 列经过重新排布而形成众多的突变基因。
• 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进 化的过程，以各种细胞为进化对象，目的 是改良细胞的各种特征，主要包括微生物 细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、 植物细胞的定向进化等。 • 随机突变方法有全基因组重排技术。 • 基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技 术相结合，对细胞进行基因组重排，从而 大幅度增加细胞的正突变频率。
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无引物PCR 突变基因 基因重组 突变基因文库 负突变基因 筛选 反复进行 正突变基因 进化酶 酶切
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变 基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变 基因。 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则 从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突 变基因出发进行DNA序列的重新排布。
一 平板筛选法
• 平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括 细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情 况。 1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳 定性和对其他极端环境条件的耐受能力等 方面有广泛应用。
2）依据颜色变化筛选突变基因
（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时， 可以用大肠杆菌β－半乳糖苷酶的基因片断 （lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当 它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有 IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色 噬菌斑。 （2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在 平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培 养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝 基酚）。
3）依据透明圈情况筛选突变基因
依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养 基中加入目的酶的作用底物，然后接种重 组细胞，在一定条件下进行培养，培养一 段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会 出现较大的透明圈。
第四节 酶定向进化的应用
• P221表8－3 一、提高酶的催化效率 二、增加酶的稳定性 三、改变酶的底物特异性
• 1）交错延伸PCR技术：在同一个反应体系中以两 个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR反应， 把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并 且大大缩短了反应时间（55℃，5s)。在反应过程 中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进 行多次变性和短时的退火－－延伸反应循环，在 每个循环中，不同长度的延伸片断在变性时与原 先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进 行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成 的DNA片断中包含有不同模板上的信息，直到获 得全长的突变基因为止。