生化技术ta
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生物大分子的分离、纯化、鉴定、定量技术
总论
常用生物大分子的分离纯化技术 特殊要求的分离纯化方法
h
1
生化与分子生物学
生化与分子生物学的研究对象：生物内的分子
生
化： 所有生物体内的分子，包括糖类、脂类、蛋白质、
核酸、有机小分子等 代谢与调控
分子生物学： 最初是生物大分子，即蛋白质、核酸, 现也是所有细胞内的分子,是生物化学的高级阶段, 基因水平
A11.9 A24 A17.8 A6.0 A0.73 B5.9 B12 B8.9 B3.0 B0h.37 17.8 36 26.7 9 1.1
A3.3 A13.3 A13.3 B6.7 B26.7 B26.7
A1.1 A6.7 A13.3 A8.9 B2.2 B13.3 B26.7 B17.8
A0.37 A3.0 A8.9 A12 A5.9 B0.73 B6.0 B17.8 B24 B11.9
h
8
系统组成
固定相（介质） 惰性支持物 流动相（展层剂）
h
9
常见层析技术类型
按 原 理 分 吸附层析 分配层析 吸附分配层析 离子交换层析 分子筛层析（凝
胶层析） 亲和层析 共价层析
按装置分 柱层析 薄层层析 纸层析 液相层析 高效液相层析/色 谱（HPLC） 气相色谱
h
10
16
1.1 9.0 26.7 36 17.8
h
17
高效液相层析
HPLC利用高压泵产生的高压力驱动流动 相流过色谱柱
很高的柱效率（分辨率），有高压、高 速、高灵敏度、易自动化等特点，灵敏 度高达10—9g（紫外检测），甚至10—11g （荧光检测）
h
18
贮液器
高压 输液泵
流动相
梯度洗脱 装置
分子筛层析（凝胶层析）：分子大小 葡聚糖Sephadex和琼脂糖凝胶 Sepharose
亲和层析：专一吸附力（配基或配体、受体）
h
14
薄层层析与纸层析
展层时分配系数不同的溶质在薄层板上 移动速率不同而得到分离
用于小分子分离分析
原点到层析点中心的距离 迁移率Rf=---------------------------------------
于另外设立了一个生化与分子生物学诺 贝尔奖。
h
4
生物化学技术与分子生物学技术
生物化学技术------分子的分离纯化鉴定定量 包括分光、层析、电泳、离心、超滤等
分子生物学技术------基因、分子水平的系列操作， 把生化、微生物免疫等技术相结合形成系统， 包括PCR技术、基因克隆表达技术、分子杂 交印迹、单克隆抗体技术、RNAi技术、基因 敲除、基因诊断与基因治疗、芯片技术、 mRNA差异显示技术等
动相）组成，利用样品各组分的物理化学性质的差异，
使待分离的各组分以不同程度分布在两相中，以不同 速度随流动相移动，最终达到分离目的。
在一定温度下达到平衡后，某种溶质在两相中的
浓度比是个常数，称分配系数（KD），它是物种的特 征常数之一。
溶质在固定相中浓度
KD=——————————
溶质在流动相中浓度
样品
进样装置
色 谱 柱
数据处理系统检测 图9 HPLC的装置和操作
h
馏分装置
19
2、电泳技术
带电颗粒在电场作用下向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳。电泳技术依 据生物分子在溶液中带电性质及分子大 小、形状有差别，从而在电场中的迁移 率不同而将其分离纯化
h
20
分类
按支持介质的不同可分为
⑴醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） ⑵ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑶聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel electrophoresis） （PAGE） ⑷等电聚焦电泳
h
5
得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子 生物学研究面临的首要问题，也是关键性的第 一步
对特定生物分子进行定性\定量分析是最常用的 研究策略
h
6
一、常用生化分离纯化技术
１.层析技术 ２.电泳技术 ３. 分光技术 ４.离心技术
h
7
1、层析技术
基本原理
层析系统都由互不相溶的两相溶剂（固定相和流
原点到溶剂前沿的距离
h
15
萃取与分配层析不同
甲乙物质在固定相A 、流动相B中 分配
系数不同：2、0.5
甲
乙
A60
A30
B30
B60
A40 A20 B20 B10
A10 A20 B20 B40
A26.7 A26.7 A6.7 B13.3 B13.3 B3.3
A17.8 A26.7 A13.3 A2.2 B8.9 B13.3 B6.7 B1.1
按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳（水平、垂直） ； ⑶ 柱电泳
h
21
琼脂糖凝胶电泳
h
22
聚丙烯酰胺电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰 胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用 下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点：
通常把原理、装置和固定相结合起来命名： DEAE纤维素柱层析 活性碳吸附柱层析 琼脂糖凝胶层析
h
11
分辨率与分离效率
分辨率 以层析系统的溶剂体积相对溶质浓度作
图，相邻两峰的分开程度称为分辨率。 分辨率反映了分离的效果。 装置的形状尺寸（例如柱层析中柱的长 度、直径），以及物质的分配系数均影 响分辨率。分配系数差异越大，则分离 峰相距愈远，分辨率越高；对柱层析而 言，柱越长越细，分辨率越高。
分离效率 单位时间内分离溶质的量称分离效率，
对柱层析来说称柱效率。分配系数差异 越大，柱越短越粗，分辨率越高
h
12
柱层析
梯度混合器
h
13
固定相不同原理不同
吸附层析：吸附力差异 活性炭、硅藻土、纤维素、氧化铝
分配层析：分配系数（溶解度）差异 滤纸
离子交换层析：极性差异 离子交换树脂、羧甲基纤维素CM、DEAE
h
2
分子遗传学
分子免疫学
分子病理学
分 分子药理学
子 医
分子毒理学
学 分子检验学
分子肿瘤学Hale Waihona Puke Baidu
……
分子生物学已成为工具性学科，已渗透到生命
科学领域包括医学的每一分支学科中,从这点讲
它已不是独立的学科.
h
3
诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学 或医学奖中有31项与生化与分子生物学 有较密切的关系，而化学奖中则有34项 相关；尤其是20世纪五十年代以来，52 ％的生理或医学奖和40％的化学奖属于 生化与分子生物学领域，二者之和相当
总论
常用生物大分子的分离纯化技术 特殊要求的分离纯化方法
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生化与分子生物学
生化与分子生物学的研究对象：生物内的分子
生
化： 所有生物体内的分子，包括糖类、脂类、蛋白质、
核酸、有机小分子等 代谢与调控
分子生物学： 最初是生物大分子，即蛋白质、核酸, 现也是所有细胞内的分子,是生物化学的高级阶段, 基因水平
A11.9 A24 A17.8 A6.0 A0.73 B5.9 B12 B8.9 B3.0 B0h.37 17.8 36 26.7 9 1.1
A3.3 A13.3 A13.3 B6.7 B26.7 B26.7
A1.1 A6.7 A13.3 A8.9 B2.2 B13.3 B26.7 B17.8
A0.37 A3.0 A8.9 A12 A5.9 B0.73 B6.0 B17.8 B24 B11.9
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系统组成
固定相（介质） 惰性支持物 流动相（展层剂）
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9
常见层析技术类型
按 原 理 分 吸附层析 分配层析 吸附分配层析 离子交换层析 分子筛层析（凝
胶层析） 亲和层析 共价层析
按装置分 柱层析 薄层层析 纸层析 液相层析 高效液相层析/色 谱（HPLC） 气相色谱
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1.1 9.0 26.7 36 17.8
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17
高效液相层析
HPLC利用高压泵产生的高压力驱动流动 相流过色谱柱
很高的柱效率（分辨率），有高压、高 速、高灵敏度、易自动化等特点，灵敏 度高达10—9g（紫外检测），甚至10—11g （荧光检测）
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贮液器
高压 输液泵
流动相
梯度洗脱 装置
分子筛层析（凝胶层析）：分子大小 葡聚糖Sephadex和琼脂糖凝胶 Sepharose
亲和层析：专一吸附力（配基或配体、受体）
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薄层层析与纸层析
展层时分配系数不同的溶质在薄层板上 移动速率不同而得到分离
用于小分子分离分析
原点到层析点中心的距离 迁移率Rf=---------------------------------------
于另外设立了一个生化与分子生物学诺 贝尔奖。
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4
生物化学技术与分子生物学技术
生物化学技术------分子的分离纯化鉴定定量 包括分光、层析、电泳、离心、超滤等
分子生物学技术------基因、分子水平的系列操作， 把生化、微生物免疫等技术相结合形成系统， 包括PCR技术、基因克隆表达技术、分子杂 交印迹、单克隆抗体技术、RNAi技术、基因 敲除、基因诊断与基因治疗、芯片技术、 mRNA差异显示技术等
动相）组成，利用样品各组分的物理化学性质的差异，
使待分离的各组分以不同程度分布在两相中，以不同 速度随流动相移动，最终达到分离目的。
在一定温度下达到平衡后，某种溶质在两相中的
浓度比是个常数，称分配系数（KD），它是物种的特 征常数之一。
溶质在固定相中浓度
KD=——————————
溶质在流动相中浓度
样品
进样装置
色 谱 柱
数据处理系统检测 图9 HPLC的装置和操作
h
馏分装置
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2、电泳技术
带电颗粒在电场作用下向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳。电泳技术依 据生物分子在溶液中带电性质及分子大 小、形状有差别，从而在电场中的迁移 率不同而将其分离纯化
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20
分类
按支持介质的不同可分为
⑴醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） ⑵ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑶聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel electrophoresis） （PAGE） ⑷等电聚焦电泳
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5
得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子 生物学研究面临的首要问题，也是关键性的第 一步
对特定生物分子进行定性\定量分析是最常用的 研究策略
h
6
一、常用生化分离纯化技术
１.层析技术 ２.电泳技术 ３. 分光技术 ４.离心技术
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1、层析技术
基本原理
层析系统都由互不相溶的两相溶剂（固定相和流
原点到溶剂前沿的距离
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15
萃取与分配层析不同
甲乙物质在固定相A 、流动相B中 分配
系数不同：2、0.5
甲
乙
A60
A30
B30
B60
A40 A20 B20 B10
A10 A20 B20 B40
A26.7 A26.7 A6.7 B13.3 B13.3 B3.3
A17.8 A26.7 A13.3 A2.2 B8.9 B13.3 B6.7 B1.1
按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳（水平、垂直） ； ⑶ 柱电泳
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琼脂糖凝胶电泳
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聚丙烯酰胺电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰 胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用 下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点：
通常把原理、装置和固定相结合起来命名： DEAE纤维素柱层析 活性碳吸附柱层析 琼脂糖凝胶层析
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11
分辨率与分离效率
分辨率 以层析系统的溶剂体积相对溶质浓度作
图，相邻两峰的分开程度称为分辨率。 分辨率反映了分离的效果。 装置的形状尺寸（例如柱层析中柱的长 度、直径），以及物质的分配系数均影 响分辨率。分配系数差异越大，则分离 峰相距愈远，分辨率越高；对柱层析而 言，柱越长越细，分辨率越高。
分离效率 单位时间内分离溶质的量称分离效率，
对柱层析来说称柱效率。分配系数差异 越大，柱越短越粗，分辨率越高
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柱层析
梯度混合器
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固定相不同原理不同
吸附层析：吸附力差异 活性炭、硅藻土、纤维素、氧化铝
分配层析：分配系数（溶解度）差异 滤纸
离子交换层析：极性差异 离子交换树脂、羧甲基纤维素CM、DEAE
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分子遗传学
分子免疫学
分子病理学
分 分子药理学
子 医
分子毒理学
学 分子检验学
分子肿瘤学Hale Waihona Puke Baidu
……
分子生物学已成为工具性学科，已渗透到生命
科学领域包括医学的每一分支学科中,从这点讲
它已不是独立的学科.
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诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学 或医学奖中有31项与生化与分子生物学 有较密切的关系，而化学奖中则有34项 相关；尤其是20世纪五十年代以来，52 ％的生理或医学奖和40％的化学奖属于 生化与分子生物学领域，二者之和相当