浅析流感病毒鸡胚培养影响因素

中 国 农村 卫 生 ２ ０ １ ６年 ７月 第 １ ４期总 第 ９ ２期 Ｃｈ ｉ ｎ ａ ＇ ｓ ｒ ｕ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ， Ｊ ｕ ｌ ｙ ２ ０ １ ６ ， Ｎｏ ． １ ４ ， Ｔｏ ｔ ａ ｌ Ｎｏ ９ ２
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浅 析 流 感 病 毒 鸡 胚 培 养 影 响 因素
马永 娟 王 彬 刘 莉 张 维娜 （ 黑龙 江 省佳 木 斯 市疾 病 预 防控 制 中心微 生 物检 验 科 １ ５ ４ ０ ０ ７ ）
【 摘 要】 目的 ： 探 讨 流 感病 毒 鸡 胚培 养 影 响 因素 。 方 法 ： 选取 经 实 时 荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 阳 性 同 时 流 感 病 毒 ＭＤ Ｃ Ｋ 细 胞 培 养 阳性 的 样 本， 用 原 始 标本 接 种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 培 养 、 传代 、 收获 、 以人 ０ 型 血 红 细 胞 凝 集试 验 测 定 病 毒 滴 度 ， 滴度 大于等 于 １ ： ８倍 用 血 凝 抑 制 试 验 鉴
定 分 型 。结 果 ： ２ ０ ５ ． １ ０ 流 感 网络 实验 室共 采 用 实 时 荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ检测样本 １ ０ ５ ２份 ， 阳性 １ ５ ５份 ， 流 感 病 毒 ＭＤ Ｃ Ｋ 细胞 培
养 血 凝 滴度 ＞ １ ： ８符合 要 求 的 阳 性 ８ ６株 。选 取 ＭＤ Ｃ Ｋ 细胞 培 养 阳性 鸡胚 敏 感 的 Ｈ１ Ｎ１ 及Ｂ —Ｖ ｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ 样本 共 ５ ７ 例 原 始 标 本 滤 过 除 茵后 接 种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 经 过 ２ —３ 代 鸡胚 培 养 收 获 血 凝 滴 度 ＞ １ ： ８符 合 要 求 的 阳性 病 毒 株 ２ Ｏ株 。 结 论 ： 流感病毒鸡胚培 养的敏感 性低 于 细胞 培 养 ， 影 响 鸡胚 培 养 的 因 素 主要 有 鸡 胚 的 选 择 ， 样 品 的毒 力及 保 存 时 间 ， 试 验 时样 品 的 处 理 无 菌 操 作 等 。 【 关键 词】 流感病毒 ； 鸡胚 培 养 ； 影 响 因素 【 中 图 分 类 号１ Ｒ ４ ４ ６ ． ５ 【 文献标识码】 Ａ 【 文章 编 号 １ １ ６ ７ ４ —３ ６ ｌ Ｘ（ ２ Ｏ ｌ ６ ） ０ ７ —０ ０ ４ ５ —０ １ 鸡 胚的选择 病毒接 种首选 ９ —１ １ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 ， 由 于 受 气 对我市 ２ ０ １ ５ ． １ ０ ． １ —２ ０ １ ６ ． ３ ． ３ １流感 高 发 季 节 的 病 毒 分 离 情 况 温影响冬季佳木斯地区无法购买到鸡 胚 ， 在 试 验 中 我 们 发 现 受 精 进行分析 ， 探 讨 影 响 流感 病 毒 鸡 胚 培养 的 因 素 。 鸡 蛋 的 胚 胎 成 活 率 非 常 不 稳 定 在 本 年 度 的 三 批 次 孵 育 中 胚 胎 成 １材 料 与 方 法 在 试 验 中 我们 发 现 鸡 胚 培 养 阳性 率 第 三 次 结 果 １ ． １标 本 来 源 ２ ０ １ ５年 １ ０ 月 １日至 ２ ０ １ ６年 ３月 ３ １日分 别 在 活 率 有 很 大 差 别 ， 可 见 受 精 鸡 蛋 的 质 量 直 接 影 响 着 鸡 胚 的成 活 率 佳 木 斯 市 两 家 流 感 监 测 哨 点 医 院 采 集 流 感 样 患 者 咽拭 子 ， 经 Ｒ ｅ ａ ｌ 明 显低 于 前 两 次 ， ｔ ｉ ｍｅ Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 阳 性 经 流 感 病 毒 ＭＤ Ｃ Ｋ 细 胞 培 养 阳 性 鸡 同 时 质 量 差 也 会 造 成 鸡 胚 非 实 验 性 死 亡 导 致 病 毒 培 养 阳 性 率 胚 敏感 的 Ｈ１ Ｎ１ 样 本 ３例 及 Ｂ —Ｖｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ 样本 ５ ４例 共 ５ ７例 。 降低 。 样 品 的 毒 力 及 存 放 时 间 对 鸡 胚 培 养 结 果 的 影 响 试 验 中 我 们 １ ． ２材 料 鸡 胚 接 种 采 用 ９ ～１ １ ｄ龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 ， 受 精 鸡 蛋 由黑 龙 江省 疾 病 预 防 控 制 中心 提 供 ， 本 实 验 室 孵 化 箱 孵 育 。人 ０ 型 红 选 择 ＭＤ Ｃ Ｋ细胞培养血凝滴度＞ １ ： ８的 阳性 标 本 接 种 鸡 胚 ， 试 验 Ｃ Ｋ细胞培养 结果 血凝滴 度高 、 出 毒 快 鸡 胚 培 养 细胞 本 实 验 室 采 集 制 备 ， 流感 病毒 标 准 诊 断 血 清 和 抗 原 由 国 家 流 中 我 们 发 现 ＭＤ 结 果 也 一 致 。我 们 接 种 的样 本 存 放 于 一７ Ｏ ℃冰箱 ， 鸡 胚 培 养 时 有 感 中 Ｕ 提供 。 些 样 品 的 存 放 时 间 会 超 过 ４个 月 。２ ０ １ ３ —２ ０ １ ４年 培 养 阳 性 ４ Ｏ １ ． ３病 毒 分 离 与 鉴 定 Ｈ１ Ｎ１ ２ ２株 Ｈ３ Ｎ ２ １ ６株 Ｂ — Ｙａ ｍａ ｇ ａ ｔ ａ ２株 。鸡 胚 培 养 ２ ４例 １ ＿ ３ ． １标 本 处 理 原 始 标 本 咽 试 子 用 滤 器 滤 过 除 菌 ， 提 取 的 尿 株 ， Ｎ １ ４株 。２ ０ １ ４ —２ ０ １ ５ 年 培 养 Ｈ３ Ｎ２阳 性 ２ ８株 Ｂ— 囊 液 和 羊膜 液 混 匀 ３ ０ ０ ０ 转 ５ 分钟 吸取上清 ， 加入 青、 链 霉 素 混 合 结 果 阳性 Ｈｌ Ｙ ａ ｍａ ｇ ａ ｔ ａ ９株 。鸡 胚 培 养 Ｂ—Ｙ ａ ｍａ ｇ ａ ｔ ａ ９ 例， 结 果 没 有 符 合 要 求 液５ ０ ｕ ｌ 于１ ｍｌ 样 品中 ， ４℃ 作 用 ４ ｈ以 上 。 １ ． ３ ． ２标 本 接 种 处 理 后 的 标 本 液 接 种 于 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 羊 膜 腔 和 的 阳 性 毒 株 。２ Ｏ １ ５ —２ ０ １ ６ ＭＤ Ｃ Ｋ 培 养 阳性 ８ ６株 其 中 Ｈ１ Ｎ１ ３株 Ｎ２ ２ ９ 株 Ｂ — Ｖｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ５ ４ 株 。鸡 胚 培 养 结 果 阳 性 Ｂ— 尿囊腔 ， 每 份 接 种 ３枚 鸡 胚 ， Ｂ型 流感 病 毒 接 种 后 置 ３ ３ —３ ５℃ 温 Ｈ３ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ２ ０株 。 因此 及 时进 行鸡 胚 培 养 尽 量 缩 短 样 品 存 放 时 间 会 箱培养 ７ ２ ｈ ， ＨＩ Ｎ１型 流 感 病 毒 接 种 后 置 ３ ３ —３ ５ ℃ 温 箱 培 养 Ｖｉ 提 高 鸡 胚 培 养 阳性 率 。 ４ ８ ｈ ， ４℃ 过 夜 或 一 ２ Ｏ ℃冷冻 ３ Ｏ 一６ ０分 钟 收 集 羊 膜 液 、 尿囊液 。 我们采用羊膜腔 、 尿 囊 腔 双 腔 接 种 将 收 获 尿 囊 液 和 羊 水 混 合 １ ． ３ ． ３血 凝 试 验 用 １ ． ５ 人 ０ 型血 红细胞 做血凝 试验 ， 血 凝 第 ２代 出 现 了 ＨＡ 阳性 株 ， 再 滴度＞１ ： １判 定 为 阳性 ， 大于 １ ： ８者 为 合 格 阳性 培 养 物 ， 用 血 凝 抑 将 第 １代 阴性 收 获 液 混 合 后 盲 传 ； 连 续 多 次 传 代 可 以提 高 制 试 验 进一 步做 型 别 鉴 定 。 阳性 但 未 达 合 格 阳性 培 养 物 者 继 续 将 阴 性 传 至 第 ３代 仍 能 出现 ＨＡ 阳性 株 ， 阳性 检 出率 。 阳性 株 ＨＡ 滴 度 ＞ １ ｔ ８时 我 们 稀 释 １ Ｏ倍 、 阳性 传至合格阳性为止 ， 阴 性 标 本 盲 传 ３代 。 ３ ２时 稀 释 １ ０ ０倍 进 行 接 种 会 减 少 鸡 胚 的 死 亡 １ ． ４数 据 处 理 采 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ９ ． ０软 件 统 计 分 析 。 Ｘ 。 检验 Ｐ ＜Ｏ ． 株 ＨＡ 滴 度 ＞ １： 率 提 高 鸡 胚 培 养 的 阳性 率 。 同 时 要 注 意 接 种 时 动 作 要 轻 柔 ， 减 少 Ｏ ５有 统计 学 意 义 。 对 鸡 胚 的刺 激 导 致 的死 亡 。 ２结 果 试 验 中 的无 菌 操 作 标 本 处 理 原 始 试 验 样 本 咽拭 子 会 含 有 大 ２ ． １ Ｒ ｅ ａ ｌ —ｔ ｉ ｍｅ Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ 结果 ２ ０ ５ ． ｉ ０ ． １ —２ ０ １ ６ ． ４ ． １本 流 感 网 络实验室共 采用 实时荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 样 本 １ ０ ５ ２份 ， 阳性 １ ５ ５份 。 量 细 菌 用 滤 器 滤 过 除 菌 是 最 简 单 实 用 的 方 法 减 少 污 染 及 抗 生 素 对 鸡 胚 的刺 激 减 少 鸡 胚 的 死 亡 率 。研 究 还 发 现 接 种 方 法 、 鸡 胚 的 其 中 ＨＩ ＮＩ ４例 Ｈ３ Ｎ２ ５ ６ 例 Ｂ —Ｖｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ９ ５例 。 血 凝 抑 制 采 用 的血 球 种 类 等 也 可 影 响 流 感 病 毒 的分 离 ２ ． ２流感 病 毒 ＭＤ Ｃ Ｋ 细胞 培养 结果 ｒ ｅ ａ ｌ —ｔ ｉ ｍｅ Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ阳 个体差异 、 ２ ３ 。 因此 影 响 鸡 胚 培 养 的 因 素 主 要 有 性 １ ５ ５例标 本 经 ＭＤ Ｃ Ｋ培养 ８ ６ 株 阳性 其 中 ＨＩ Ｎ１ ３株 Ｈ３ Ｎ２ ２ ９ 率 和 病 毒 的血 凝 滴 度判 定 ［ 鸡 胚 的选 择 ， 样 品 的毒 力 及 保 存 时 间 ， 传代 次数 ， 试 验 时样 品 的 处 株Ｂ —Ｖ ｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ５ ４株 。 ２ ． ３流 感 病 毒 鸡 胚 培 养 选 取 Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ 细 胞 培 养 阳 性 鸡 胚 敏 感 理 无 菌 操 作 等 。 参 考 文 献 的 ＨＩ Ｎ１及 Ｂ —Ｖ ｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ 样本共 ５ ７例 原 液 接 种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 经 过 ２ — － ｌ ｌ 姚红 ， 黄洋 ， 张静 ． 流 感 病 毒 的 实 验 室 检 测 方 法 及 进 展 探 究 ３代 鸡 胚 培 养 收 获合 格 阳性 病 毒 株 Ｂ— Ｖｉ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ａ ２ ０株 。不 同 月 份 ［ 的 鸡 胚 培 养 阳性 率 差 异 有 统 计 学 意 义 ， 流 感 病 毒 鸡 胚 培 养 阳 性 率 ［ Ｍ］ ． 医学 信 息 ２ ０ １ ３年 ７月 第 ２ ６卷 ２ ． ［ ２ ］ 杨式芹 ， 何芸 ， 陈前进 ， 等． ２ ０ ０ ６年 福 建 不 同 地 区 流 感 监 测 病 原 明 显 低 于 ＭＤ Ｃ Ｋ 细 胞 分 离 阳性 率 。 学监测结 果分析Ｉ － Ｊ ］ ． 海 峡 预 防 医学 杂 志 ， ２ ０ ０ ８ ， １ ４ （ ５ ） ： ３ ９ —４ １ ． １ ． ��