生命的化学

文章编号:100021336(2001)0520403202植物缺氧、缺铁胁迫的功能蛋白质组学

柴东方　裴凌鹏　李　伟　印莉萍

(首都师范大学生物系,北京100037)

关键词:功能蛋白质组学;缺氧胁迫;缺铁胁迫

中图分类号:Q31

收稿日期:2001206204

国家重点基础研究发展规划项目(973G 1999011700)资助

作者简介:柴东方(1962—

)学士,女,汉族,现为首都师范大学访问学者;印莉萍(1953—

),女,硕士,汉族,首都师范大学生物系教授。

九十年代中期,国际上出现了一门研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科———蛋白质组学(proteomics )[1]和中国人提出的功能蛋白质组学(functional pro 2teomics )[2]。

功能蛋白组学是位于对个别蛋白质的传统研究,和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。是从“局部”入手,研究定位在细胞内与某个功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。在当前蛋白质组研究主要集中在蛋白质的表达模式研究上,本文主要介绍在缺氧胁迫和缺铁胁迫下,植物蛋白质表达模式的研究进展。

1.氧胁迫时蛋白质表达模式研究

Chang 等[3]对玉米根尖蛋白质合成模式的研究,在蛋白质的研究领域中具有十分突出的指导和借鉴作用。他们首先对玉米幼苗进行2～4小时的低氧处理,使玉米根尖的缺氧耐受性得到很大的提高。在缺氧和低氧适应过程中进行对蛋白质合成模式的分析,通过定量让[35S ]2甲硫氨酸标记总蛋白质,在含氧正常、低氧、缺氧环境中找到262种单个蛋白质,并根据考马斯亮蓝或银染结果,将分离效果十分好的48种蛋白质通过双向IEF 2SDS 2PA GE 分离出来,通过离析、胰酶消化以

后,用MALDI 2TOF (基质辅助激光解吸电离

飞行时间质谱)分析,鉴定出了46种蛋白质,这是第一个用质谱(mass spectrometry )技术鉴定出的植物蛋白系统[4]。他们研究的目的是为了区分对低氧胁迫产生适应性的玉米根尖合成蛋白质的不同作用。在实验中观察到玉米根尖在适应低氧胁迫之前、之中及之后蛋白质合成模式,并根据实验结果认为蛋白质的合成对于促进胞质内p H 值调节及提高缺氧存活率十分有作用。而且通过双向凝胶电泳及质谱仪的检测,发现46种被鉴定的蛋白质合成比例发生了改变。

在氧胁迫时,对植物蛋白质表达模式的研究表明,适应应答是一个复杂的过程,任何单一基因的表达水平与缺氧耐受性的关系都不是那样简单,而且大量成套基因产物可能结合在一起去提高耐受性,这个过程需要整体的基因表达模式的分析。目前尚不能将某些特定蛋白质合成的增加或减少与它们在适应性反应中的重要性对应起来。而且在转录、翻译、翻译后修饰、基因产物的亚细胞定位及蛋白质降解等过程中都能通过调节基因的表达及相关蛋白质的活力来控制基因的功能。在蛋白质水平上研究复杂的基因表达模式,利用双向IEF 2SDS 2PA GE 及MS 相结合是一种有效的方法,并且比Edman 降解法有更高的灵敏性,能对大量蛋白质进行研究[3]。

2.铁依赖的蛋白质表达模式研究

Herbik 等[5]在铁依赖的蛋白质在西红柿野生型(L ycopersicon esculent um M ill cv

Bonner Beste )和尼克烟酰胺突变株(chln )中

表达的变化的研究中,利用一维和二维电泳分离蛋白质,并在PVDF 膜上用电印迹法找

到染色后的蛋白质斑,利用气相蛋白质测序仪L F3400将蛋白质排序,进行同源关系的比较研究。证明了铁充足与铁缺乏的野生株和突变株根尖二维凝胶电泳表现出了不同的蛋白型,在铁缺乏的野生株和铁充足与铁缺乏的突变株的根尖中,甘油醛232磷酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的表达量都增加了。烟酰胺缺失突变株,出现植株铁缺乏和植株茎中铜的积累,说明烟酰胺与铁、铜转运有关,缺氧和氧胁迫响应的酶的变化也与不同器官铁、铜浓度的变化有关。

本研究室在关于水稻缺铁条件下相关基因的表达在功能蛋白质组水平上的研究中,采用了缺铁和以柠檬酸铁、ED T A螯合二价铁、FeCl3为铁源的四种不同营养条件下培养6天的水稻为实验材料。分别提取根可溶性蛋白,进行SDS2PA GE分析。在缺铁和FeCl3为铁营养条件下,发现一条43kD蛋白质加强表达。分别对提取的四种根可溶性蛋白进行双向IEF2SDS2PA GE,均得到多达1500个左右的蛋白质点。通过对缺铁和以柠檬酸铁为铁营养培养的水稻根可溶性蛋白的双向电泳结果进行比较、分析,发现缺铁时有3个加强表达、8个减弱表达、9个特异表达的蛋白质点;柠檬酸铁为铁营养时有3个蛋白质特异表达;总共有23个较大差异的蛋白质点。对缺铁与ED T A螯合二价铁为铁营养培养的水稻根可溶性蛋白的双向电泳结果的比较、分析,也得到23个差异蛋白质点,其中缺铁时加强表达有4个,减弱表达有2个,特异表达有7个;ED T A螯合二价铁为铁营养时特异表达有10个,且集中在小分子量、酸性区。在对缺铁与FeCl3为铁营养培养的水稻根可溶性蛋白的双向电泳分析结果比较中,未发现明显的特异表达蛋白质点。通过凝胶图像分析,得到了差异蛋白质点的大约相对分子量和等电点。从凝胶上提取其中23个点的蛋白质,用胰酶进行酶解。继而进行了MALDI2TOF检测,得到了19张蛋白质的肽质量指纹谱。对其中较理想的14种蛋白质的肽质量指纹谱进行数据检索、分析,证明在缺铁时,NAD2依赖的甲酸脱氢酶、核苷二磷酸激酶、延长因子21α3种蛋白质加强表达。

为鉴定缺铁诱导的蛋白质,Suzuki等[6]研究了大麦根部缺铁诱导的无氧代谢中的甲酸脱氢酶(FDH),利用2D2PA GE方法分离多肽,通过电印迹将肽转移到PVDF膜上并用考马斯亮蓝染色,载下PVDF膜上的每一个条带。在气相测序仪上通过自动化Ed2 man降解分析氨基酸序列。诱导蛋白的肽序列分析表明,在缺铁根部FDH、磷酸核糖基转移酶和Ids3基因产物(缺铁特异性的)增强表达。比较大麦根部铁缺乏和铁充足条件下的蛋白质2D分布图,鉴定一个36kD的蛋白质,该蛋白质是缺铁特异诱导的。他们还表征了大麦根部铁缺乏胁迫诱导的其他几种蛋白质,其中一种就是FDH。不仅缺铁能诱导Fdh表达,在无氧下Fdh也表达,并且其表达比缺铁诱导还要快。因而在缺铁大麦根部的Fdh表达是由氧胁迫所造成的第二种效应。

功能蛋白质组研究当前还处在一个初期发展的阶段,相关技术手段及其配套应用还处于探索阶段。因此,功能蛋白质组研究技术体系的建立、优化与改进成为蛋白质组学目前的主要目标之一。本文所介绍的缺氧胁迫及缺铁胁迫的研究是对功能蛋白质组学的方法应用较成功的实验,我们可以借鉴、改进并结合我国目前的研究状况,充分利用已有的研究基础与积累,包括生命科学、信息科学、物理学、化学、医学、药物等科学理论与技术方法和分子生物学、结构生物学、细胞生物学、基因组学等的前沿研究成果,开展蛋白质组学研究,特别是功能蛋白质组学的研究。

参考文献

[1]　李林等.生命科学,1999,11(2):49—50

[2]　李伯良.生命的化学,1998,18(6):1—3

[3]　Chang WWP et al.Plant Physiology,2000,122:

295—317

[4]　Z ivy M et al.Plant Molecular Biology,2000,44:575—580

[5]　Herbik A et al.Plant Physiol,1996,111:533—540

[6]　Suzuki K et al.Plant Physiol,1998,116:725—732