光学显微镜的介绍
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原理：主要由物镜和目镜组成，物镜的焦距很短，目镜焦距长，物镜作用是得 到物体放大的实象，目镜是将物镜所成实象作为物体得到放大的虚象。
A ' 物体 AB到物镜L1距离稍大于物镜焦距F1, 通过物镜得到放大的实象 A' B '， ' B位于 目镜的焦距F2以内，是目镜的物体，通过目镜得到放大虚象 A'' B ''。
Leiting Pan, Nankai University
二.显微镜相关参数
2.6显微镜物镜
1.色差（Chromatic aberration):光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率 也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能 就是消色差.单色光不产生色差。 2.球差(Spherical aberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形 表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间 亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。 3.慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出 的光束通过透镜后，不再相交一点，则光点的像便会得到如豆点状，型如慧星， 故称“慧差”。 4.像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大 时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。象散使原来的 物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线。 5.场曲（Curvature of field）：场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时， 整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但 整个像平面则是一个曲面。 6.畸变（Distortion）除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差， 光束的同心性不受到破坏。因此，不影响象的清晰度，但使象与原物体比，在形 状上造成失真。
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三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
环形光阑（实物图）：不同的环状孔形 成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同 的物镜相匹配的。由于透明圆环所成的 像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的 共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射 光便通过共轭面。其作用是将直射光所 形成的像从一些衍射旁像中分出来 。 相位板（观察图）：安ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在物镜的后 焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜 和推迟相位的相位膜。它除能推迟直 射光线或衍射光的相位以外，还有吸 收光使亮度发生变化的作用。 Leiting Pan, Nankai University
电子显微镜
扫描隧道显微镜（STM） 扫描电子显微镜（SEM） （反射） 透射电子显微镜（TEM） 发射式电子显微镜
一.背景简介
1.2显微镜类别
Fig.1 正置显微镜
Fig.2 倒置显微镜
Fig.3 体视显微镜
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二.显微镜相关参数
2.1 显微镜光学原理
介质 折射率 空气 1 水 1.33 香柏油 1.515 α溴萘 1.66
提高分辨能力方法：使用低波长光源，增大介质n值，增大孔 径角，提高对比度。 Leiting Pan, Nankai University
二.显微镜相关参数
2.2显微镜放大率 显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。 显微镜放大是指被观察物的一维尺度放大。 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显 微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放 大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图 像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而 放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图 像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥 显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率 合理匹配。
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一.背景简介
1.2显微镜类别 光学显微镜
倒（正置）置显微镜 体视显微镜 金相显微镜 偏光显微镜 相差显微镜 干涉显微镜 微分干涉对比显微镜（DIC) 倒置（正置）荧光显微镜 数码显微镜 Leiting Pan, Nankai University
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三.显微镜一些成像原理
3.1 阿贝成象
Fig.32 阿贝成象原理示意图
Fig.6 三种空间滤波器 Leiting Pan, Nankai University
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色 不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色 的透明物体。 光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和 颜色的变化，而只产生所谓的相位差。可是这种相 位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。 相差显微镜利用阿贝成像原理，把相位信息转化为 振幅信息，是观察透明物体的关键。
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
切片不能太厚，一般以5-10μm为宜。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来 的光路，同时被延迟了1/4λ（波长）， 如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增 大或减下，提高反差。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波 合轴后光波相加，振幅加大，标本结构 比周围介质更加变亮，形成亮反差（或 称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线 合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反 Fig.8 1953年诺贝尔物理 差（或称正反差），结构比周围介质更 学奖得主荷兰人泽尔尼克 加变暗。 Leiting Pan, Nankai University
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重 合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。 否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被 吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波 不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 Fig.7 相差显微镜原理示意图
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二.显微镜相关参数
2.4 显微镜参数视场数/视场直径 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场 。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视 场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈 便于观察。 F=FN/β ，F-视场直径，FN-视场数（Field Number）， β-物镜放大率。 蔡司视场数是23mm ，用100X的物镜，其视场数是 23mm/100＝0.23mm，就是说把一个0.23mm的线段放 在显微镜下观察，线段两端正好在视野边缘。
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二.显微镜相关参数
2.3显微镜焦深 焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准 某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看 清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得 清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深与物镜的数值孔径及分辨率成反比，物镜低倍 到高倍切换再调焦，反之则不用。
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二.显微镜相关参数
2.6显微镜物镜 1.消色差物镜（Achromatic objective）：校正了轴 上红，蓝二色点的位置色差、黄绿光球差。 2.复消色差物镜（Apochromatic objective）：校正 红、绿、蓝三色光的色差，校正红、蓝两色光的球差。 3.半复消色差物镜（Semi apochromatic objective） 校正红、蓝两色光的球差和色差。 4.平视场物镜（Plan objective ）：视场平坦，校正 场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。 5. 单色物镜：紫外物镜 6. 特种物镜：相衬物镜，长工作距离物镜。
Introduction to Optical Microscopy
The Speaker: Leiting Pan The Tutor: Jingjun Xu
Leiting Pan, Nankai University
内容
一.背景简介 二.显微镜相关参数 三.显微镜一些成像原理 四.荧光显微镜
五.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM)
三.显微镜一些成像原理
3.3 微分干涉差成像（DIC）
组成：有四个特殊的光学组件-偏振器（polarizer）、DIC棱 镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。
原理：微分干涉相衬差成像是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分 解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等， 光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，由于标本的厚 度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差，在相位上略 有差别。调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可 改变影像的亮度。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同 偏振面的两束光，从而使二者发生干涉，使标本的细微结构 呈现出正或负的投影形象。由于两光束的裂距极小（小于显 微镜分辨率），而不出现重影现像，使图像呈现出立体的三 维感觉。
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一.背景简介
1.1显微镜发展史
1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。 1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时， 改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜。 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能 力大为提高。 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰 物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝 尔物理学奖。 19世纪20年代，恩斯特· 鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能 够把实物放大17倍，他获得了1986年诺贝尔奖的物理奖，现在可得 到百万倍的放大，
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二.显微镜相关参数
2.5 显微镜参数工作距离/覆盖差
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的 距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。 因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是 调节工作距离。 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标 准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从 而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的 成响质量。 数值孔径越大的物镜，工具距离越短，对盖玻片厚度有一定的 要求。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围 在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算 在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的 厚度。
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三.显微镜一些成像原理
3.1 阿贝成象
阿贝成像原理: 物是一系列不同空间频率的集合.入射光经物 平面发生夫琅和费衍射,在透镜焦面(频谱面)上形成一系列衍 射光斑,各衍射光斑发出的球面次波在相面上相干叠加,形成 像。 阿贝成像原理将成像过程分为两步:第一步“分频”;第二步 “合成”。 由阿贝的观点来看：许多成像光学仪器就是一个低通滤波器, 物平面包含从低频到高频的信息,透镜口径限制了高频信息通 过,只许一定的低频通过,因此,丢失了高频信息的光束再合成, 图象的细节变模糊. 孔径越大,丢失的信息越少,图象越清晰. 意义：用频谱语言来描述信息,它启发人们用改造频谱的方法 来改造信息。
Fig.4 显微镜 光路示意图
A'' B '' AB
L1
A' B '
L2
观察者
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二.显微镜相关参数
2.1显微镜分辨能力
Fig.5 改变数值孔 径示意图
R
0.61 0.61 NA n sin 2
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值 0.2μm左右，人眼的在明视距离分辨力是0.2mm，所以一般显 微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
A ' 物体 AB到物镜L1距离稍大于物镜焦距F1, 通过物镜得到放大的实象 A' B '， ' B位于 目镜的焦距F2以内，是目镜的物体，通过目镜得到放大虚象 A'' B ''。
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二.显微镜相关参数
2.6显微镜物镜
1.色差（Chromatic aberration):光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率 也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能 就是消色差.单色光不产生色差。 2.球差(Spherical aberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形 表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间 亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。 3.慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出 的光束通过透镜后，不再相交一点，则光点的像便会得到如豆点状，型如慧星， 故称“慧差”。 4.像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大 时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。象散使原来的 物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线。 5.场曲（Curvature of field）：场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时， 整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但 整个像平面则是一个曲面。 6.畸变（Distortion）除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差， 光束的同心性不受到破坏。因此，不影响象的清晰度，但使象与原物体比，在形 状上造成失真。
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三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
环形光阑（实物图）：不同的环状孔形 成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同 的物镜相匹配的。由于透明圆环所成的 像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的 共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射 光便通过共轭面。其作用是将直射光所 形成的像从一些衍射旁像中分出来 。 相位板（观察图）：安ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在物镜的后 焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜 和推迟相位的相位膜。它除能推迟直 射光线或衍射光的相位以外，还有吸 收光使亮度发生变化的作用。 Leiting Pan, Nankai University
电子显微镜
扫描隧道显微镜（STM） 扫描电子显微镜（SEM） （反射） 透射电子显微镜（TEM） 发射式电子显微镜
一.背景简介
1.2显微镜类别
Fig.1 正置显微镜
Fig.2 倒置显微镜
Fig.3 体视显微镜
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二.显微镜相关参数
2.1 显微镜光学原理
介质 折射率 空气 1 水 1.33 香柏油 1.515 α溴萘 1.66
提高分辨能力方法：使用低波长光源，增大介质n值，增大孔 径角，提高对比度。 Leiting Pan, Nankai University
二.显微镜相关参数
2.2显微镜放大率 显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。 显微镜放大是指被观察物的一维尺度放大。 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显 微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放 大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图 像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而 放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图 像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥 显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率 合理匹配。
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一.背景简介
1.2显微镜类别 光学显微镜
倒（正置）置显微镜 体视显微镜 金相显微镜 偏光显微镜 相差显微镜 干涉显微镜 微分干涉对比显微镜（DIC) 倒置（正置）荧光显微镜 数码显微镜 Leiting Pan, Nankai University
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三.显微镜一些成像原理
3.1 阿贝成象
Fig.32 阿贝成象原理示意图
Fig.6 三种空间滤波器 Leiting Pan, Nankai University
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色 不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色 的透明物体。 光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和 颜色的变化，而只产生所谓的相位差。可是这种相 位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。 相差显微镜利用阿贝成像原理，把相位信息转化为 振幅信息，是观察透明物体的关键。
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
切片不能太厚，一般以5-10μm为宜。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来 的光路，同时被延迟了1/4λ（波长）， 如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增 大或减下，提高反差。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波 合轴后光波相加，振幅加大，标本结构 比周围介质更加变亮，形成亮反差（或 称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线 合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反 Fig.8 1953年诺贝尔物理 差（或称正反差），结构比周围介质更 学奖得主荷兰人泽尔尼克 加变暗。 Leiting Pan, Nankai University
三.显微镜一些成像原理
3.2 相差成象
必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重 合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。 否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被 吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波 不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 Fig.7 相差显微镜原理示意图
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二.显微镜相关参数
2.4 显微镜参数视场数/视场直径 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场 。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视 场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈 便于观察。 F=FN/β ，F-视场直径，FN-视场数（Field Number）， β-物镜放大率。 蔡司视场数是23mm ，用100X的物镜，其视场数是 23mm/100＝0.23mm，就是说把一个0.23mm的线段放 在显微镜下观察，线段两端正好在视野边缘。
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二.显微镜相关参数
2.3显微镜焦深 焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准 某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看 清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得 清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 焦深与物镜的数值孔径及分辨率成反比，物镜低倍 到高倍切换再调焦，反之则不用。
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二.显微镜相关参数
2.6显微镜物镜 1.消色差物镜（Achromatic objective）：校正了轴 上红，蓝二色点的位置色差、黄绿光球差。 2.复消色差物镜（Apochromatic objective）：校正 红、绿、蓝三色光的色差，校正红、蓝两色光的球差。 3.半复消色差物镜（Semi apochromatic objective） 校正红、蓝两色光的球差和色差。 4.平视场物镜（Plan objective ）：视场平坦，校正 场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。 5. 单色物镜：紫外物镜 6. 特种物镜：相衬物镜，长工作距离物镜。
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内容
一.背景简介 二.显微镜相关参数 三.显微镜一些成像原理 四.荧光显微镜
五.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM)
三.显微镜一些成像原理
3.3 微分干涉差成像（DIC）
组成：有四个特殊的光学组件-偏振器（polarizer）、DIC棱 镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。
原理：微分干涉相衬差成像是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分 解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等， 光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，由于标本的厚 度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差，在相位上略 有差别。调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可 改变影像的亮度。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同 偏振面的两束光，从而使二者发生干涉，使标本的细微结构 呈现出正或负的投影形象。由于两光束的裂距极小（小于显 微镜分辨率），而不出现重影现像，使图像呈现出立体的三 维感觉。
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1.1显微镜发展史
1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。 1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时， 改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜。 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能 力大为提高。 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰 物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝 尔物理学奖。 19世纪20年代，恩斯特· 鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能 够把实物放大17倍，他获得了1986年诺贝尔奖的物理奖，现在可得 到百万倍的放大，
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二.显微镜相关参数
2.5 显微镜参数工作距离/覆盖差
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的 距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。 因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是 调节工作距离。 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标 准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从 而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的 成响质量。 数值孔径越大的物镜，工具距离越短，对盖玻片厚度有一定的 要求。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围 在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算 在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的 厚度。
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三.显微镜一些成像原理
3.1 阿贝成象
阿贝成像原理: 物是一系列不同空间频率的集合.入射光经物 平面发生夫琅和费衍射,在透镜焦面(频谱面)上形成一系列衍 射光斑,各衍射光斑发出的球面次波在相面上相干叠加,形成 像。 阿贝成像原理将成像过程分为两步:第一步“分频”;第二步 “合成”。 由阿贝的观点来看：许多成像光学仪器就是一个低通滤波器, 物平面包含从低频到高频的信息,透镜口径限制了高频信息通 过,只许一定的低频通过,因此,丢失了高频信息的光束再合成, 图象的细节变模糊. 孔径越大,丢失的信息越少,图象越清晰. 意义：用频谱语言来描述信息,它启发人们用改造频谱的方法 来改造信息。
Fig.4 显微镜 光路示意图
A'' B '' AB
L1
A' B '
L2
观察者
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二.显微镜相关参数
2.1显微镜分辨能力
Fig.5 改变数值孔 径示意图
R
0.61 0.61 NA n sin 2
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值 0.2μm左右，人眼的在明视距离分辨力是0.2mm，所以一般显 微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。