蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定

一、实验目的

1.学习考马斯亮蓝测定蛋白的原理

2.了解分光光度计的使用

3.注意小组的分工合作

二、原理

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，后者最大光吸收在595nm。蛋白浓度在0-100μg/ml范围以内，蛋白质-色素结合物在595nm下吸光度与蛋白质含量呈正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。

三、仪器、器皿及试剂

天平、试管、吸管、研钵、50ml容量瓶、离心管

标准牛血清蛋白液（100μg/ml）、G-250溶液。

四、实验步骤

1.标准曲线绘制

2.样品蛋白质含量测定

①准确称量1g菠菜和青菜，加入5ml蒸馏水研磨，研磨成匀浆，离心（4000r/min，10mins）后，上清液转入50ml容量瓶，并用蒸馏水定容。

五、作业

集中在吸光值0.050-0.150之间，在图像的前段，所以经过讨论后，我组将第5、6个数据去除，而保留了第1、2、3、4个数据，最后得出了如下图的标准曲线。

2.计算样品中蛋白质含量

菠菜的蛋白质含量= 3.511ug × 500 = 1755.5ug = 1.756mg

青菜的蛋白质含量= 5.507ug × 500 = 2753.5ug = 2.754mg 即是说，1g菠菜中含有1.756mg的蛋白质，即菠菜的蛋白质含量为1.756‰；1g青菜中含有2.754mg的蛋白质，即青菜的蛋白质含量为2.754‰。

3.实验结果分析及讨论

①青菜的蛋白质含量比菠菜的蛋白质含量高1‰左右。

②误差分析：

A.标准曲线制作过程中，所测量的溶液用的是1ml的体系，这样溶液加多加少本身会有一定的区别。所以配置标准液时，最好是由一个人操作，或至少由一个人将一种溶液加完；还有就是测量的溶液体系最好可以在大一点，这样由操作引起的误差可以降低一些。

B.在测定吸光值时，需先将分光光度计打开预热，目的是稳定它的波长；因为测量数据是分两步进行的，所以最好用同一台仪器测定。

C.吸光值测定时，最好是使用的同一个空白，因此在测完标准曲线的吸光值后，要将空白留下来，后面测样品的吸光值时使用；也可以同时配置两个空白，分两次使用。

D.样品研磨时，一定要研磨充分，才能使蛋白质提取充分，若两种样品研磨的程度不同，那么提取蛋白质的程度也不相同，最后的结果也不具有可比性。

E.结果中所测吸光值都偏小，一般最好是落在曲线的中间部位，否则就会影响测量的准确度，因此样品的稀释倍数最好可以适当减小，样品的测量体系也可以适当增大。

③建议：

A.最好适当增大溶液测量的体系，如增加到5ml或10ml，一方面可以降低人为操作引起误差的影响，另一方面测量时润洗和测量都有足够的材料，若是对测量的结果不肯定，还可以用剩余的样品液再测一次。

B.标准曲线的绘制和样品的测量最好可以同时进行。静置的时间不同，显色反应的程度也就不同了，若用同一个空白，在测量完标准液后，过一段时间再测样品液，本身就存在有误差。所以，最好是先制备样品液的母液，然后标准液和样品液的测量体系可以一同配置，最后一起测量，也有助于减少误差。

C.为了使蛋白质提取充分，可以适当增加离心的次数。

④其他：为了安全使用离心机，有时可以不必太严格的遵照实验操作的要求，比如此次试验，要求离心4000r/min 10min，但所用的离心机最高转速在4000r，在使用时，可以稍微降低转速（如到3990r），稍微延长离心时间（如到11-12min）。最后所得到的结果是一样的。其实，在实验过程中，除了要注意实验操作的规范以外，还需注意实验仪器、设备的安全使用，什么时候该严格遵守操作规范，什么时候可以适当变通，在试验正式开始之前就要做好安排。