蚕豆病素材课件

A 540 血红蛋白含量（mmol）= 44
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3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 G6PD比活性单位（U/g Hb）
= A 340 1 1 4 4 10 10 0 1000 6.22100.02 A 54 064 5 10 10
= A340 49.85
A5 4 0
2010级本科分子生物学实验设计
阅读下列案例，根据要求回答问题并设计实验进一步明确诊断。
案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜
蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据 家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。
体 格 检 查 ： 体 温 38℃ ， 脉 搏 150 次 / 分 ， 呼 吸 40 次 / 分 ， 血 压 80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄 染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾 区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆 红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血 (+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。
（2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：称取NADP ＋ 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4 ℃可保存20天左右。
（3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二钠(G6P－Na2)：称取21.5mg G6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 ℃可保存20天左右。
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易发人群
多见于儿童，男性患者约占90%以上。
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临床表现
早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、 腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈 酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3 日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、 腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约 50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性 肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。
试剂
体积
Drabkin(mL)
0.3
溶血液(mL)
3.0
混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm 的吸光度（A540）。
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（三）注意事项
1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。
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（四）结果分析
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一、根据上述患儿的临床 表现和实验室检查，初步 判断患儿是何种疾病
蚕豆病
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皮肤及巩膜黄染 恶心、呕吐、面色苍白 尿液镜下未见红细胞
黄疸 红细胞膜不完整，已破裂
血红蛋白53g/L
血红蛋白量减少
溶
尿蛋白（++）
血 性
黄
血清总胆红素85.5µmol/L
含量明显增加
疸
蚕豆病
红细胞 1.98×1012/L
红细胞含量少
游离胆红素增加
尿胆红素(－)
尿胆素原(+)
肠肝循环增多
排尿呈酱油样色
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蚕豆病简介
蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺 乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆 后突然发生的急性血管内溶血。
（6）0.9% NaCl，ACD抗凝剂。
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（二）实验操作流程
1、洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含 0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL 抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水， 轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复 三次。
2、溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂 2.0mL，震荡1min，4℃放置10min以上。
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二、设计实验进一步 明确诊断
红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活 性测定（紫外法）
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（一）实验器材和试剂
1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。
2.试剂
（1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取 Tris12.1g,MgCl2·6H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl 调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。
【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb
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三、从生化代谢解释 患儿的临床表现和实 验室检查结果
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3、NADPH的测定 取石英比色杯两只，标为“测定”及 “空白”，按下表操作：
试剂
蒸馏水（uL） 0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（uL） 6mmol/L G6P-Na2 (uL) 2mmol/L NADP+ (uL)
体积
2040 300 300 300
混匀后放入带恒温水循环（25℃）的紫外分光 光度计中，预热10min 然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入 溶血剂60uL，混匀
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以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每 2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况， 若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（△A340）计 算NADPH的产量。
4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作：
1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔 的吸光系数（ε）为6.220，故10min内NADPH的产量计算 公式为：
A 340 NADPH产量（μmol）= 6 .22
2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以 后，在540nm处，其毫摩尔吸光细数（ε）为44，故溶血 液中血红蛋白的含量计算公式为：
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（4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL， 6mmol/L NADP＋ 0.4mL，加蒸馏水至总体积 200mL。
（5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取 K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g， 加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保 存20天。