六、脲酶米氏常数简易测定2010(精)
简便法测定脲酶含量
简便法测定脲酶含量
简便法测定脲酶含量通常使用间接法，即测定尿液中尿素的产生量。
具体方法如下：
材料：碱性磷酸盐缓冲液、尿液样品、脲酶试剂（含间苯二酚）、少量尿素。
步骤：
1. 准备样品：取适量的尿液样品。
2. 离心：将尿液样品离心，以去除杂质。
3. 反应液的制备：在试管中加入适量的碱性磷酸盐缓冲液和脲酶试剂。
4. 反应液的预热：将试管置于恒温水浴中，预热至适当的温度。
5. 打断反应：将预热的反应液加入样品中，迅速混合，打断反应。
6. 倍化尿素：将适量的尿素加入反应液中，促使脲酶的活性增加。
7. 反应时间：将试管放置在恒温水浴中反应一定时间。
8. 终止反应：加入酸性溶液，终止反应。
9. 高速离心：将反应液离心，以去除沉淀。
10. 测定吸光度：取上清液，使用分光光度计测定吸光度。
11. 计算脲酶含量：根据吸光度测定结果，通过对照物质的标准曲线，计算脲酶含量。
需要注意的是，尽管这种方法相对简便，但仍需要一定的实验操作技巧和仪器设备，同时还需要对研究对象进行合适的前处理，以提高测定的准确性和可靠性。
脲酶实验的测定实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。
2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。
3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。
在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。
3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。
五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。
2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。
六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。
2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。
七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。
2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
脲酶Km值的测定(2009)
脲酶Km值的测定一、[背景与目的]K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等中均具有重要意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下:(1)酶促反应(2）呈色反应通过本实验学习大豆脲酶的提取方法；掌握脲酶米氏常数Km的测定方法。
二、[仪器与试剂]1. 仪器(1) 721型分光光度计 (2) 恒温水浴锅2.试剂(1) 0.05mol/L尿素溶液(2) 0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液(3) 10%ZnSO4溶液(4) 0.5mol/LNaOH溶液(5) 10%酒石酸钾钠溶液(6) 奈氏试剂三 [实验方法]1. 脲酶提取液的制备（由老师准备）2. 取5支试管编号,按下表加入试剂和操作,加入试剂量单位为mL25℃恒温水浴，预温5min25℃恒温水浴，准确作用10min充分混匀，过滤另取5支试管，与上述离心管对应编号，如下操作混合均匀，以对照管调零，在480nm处，读取各管的A480nm值以酶促反应初速度的倒数为纵坐标（以1/ A480nm代替），以保温混合液中脲酶提取液浓度，以mol数计的倒数为横坐标，按双倒数作图法，求得K m值*[S]=每管中尿素的mol数/4.1mL×10-3（4.1mL为酶促反应总体积）五、[注意事项]（1）米氏方程系线性方程，酶促反应初速度v与光吸收值A成正比，所以用1/A代表1/v 作图求K m值，方法简便，且结果不受影响。
脲酶Km值的简易测定(精)
实验九脲酶Km值的简易测定目的和要求掌握测定米氏常数的原理和方法，学习并掌握一般的数据处理方法原理O CNH2NH2+脲酶(NH4)2CO3(NH4)2CO3+ NaOH + ( KI )2HgI OHgHgNH2I (橙黄色)步骤1脲酶的提取：称取大豆粉1克，加入30%的乙醇25mL，充分摇匀后，置于冰箱中过夜，次日用2000rpm离心3分钟，取上清液备用。
2标准曲线的制作：按下表加入各种试单位：mL管号硫酸氨蒸馏水氢氧化钠酒石酸钾钠奈氏试剂1 2 3 4 5 60.10.150.200.250.305.85.75.655.65.555.50.20.20.20.20.20.20.50.50.50.50.50.51.01.01.01.01.01.0立即摇匀各管，于460nm下比色，1号管为参比。
3酶促反应速度的测定：按下表操作单位：mL管号尿素浓度尿素加入量磷酸缓冲液保温时间脲酶加入量煮沸脲酶保温时间硫酸锌蒸馏水氢氧化钠1 2 3 4 5 0.0500.0330.0250.0200.0200.200.200.200.200.200.600.600.600.600.6037度水浴保温5分钟0.200.200.200.20/////0.2037度水浴保温10分钟0.500.500.500.500.503.0 0.53.0 0.53.0 0.53.0 0.53.0 0.5摇匀，静置5分钟后，于3000rpm离心5分钟，取上清液，供下步使用。
4从标准曲线方程中脲酶作用于不同浓度尿素生成碳酸铵的量，然后以取单位时间碳酸铵生成量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的尿素浓度的倒数即1/[S]为横坐标，应用最小二乘法公式，求出方程，计算Km值。
思考题Km值的物理意义是什么？为什么要用酶反应的初速度计算Km值？本实验的关键是什么？。
实验六 脲酶的Km值简易测定(WT)
注意事项
1.
每加一种试剂后务必摇匀，尤其在37℃保温后和加 入显色液后；
2.
3. 4.
变性脲酶液要煮沸，并确保脲酶变性完全；
奈氏试剂腐蚀性强，操作时要戴手套，勿洒在试管 架和实验台面上； 重金属离子，蛋白质等可影响酶活，实验后需彻底 清洗试管等实验用品。
试剂（mL） 1/15 mol PB 10 mmol/L 脲液 脲酶液 煮沸脲酶液
充分混匀，室温下放置 5 min，过滤
100 g/L 酒石酸钠
奈氏试剂 蒸馏水 滤液
0.25
0.5 2 1
0.25
0.5 2 1
0.25
0.5 2 1
0.25
0.5 2 1
0.25
0.5 2 1
迅速混匀，于460nm处，以对照组调零，并测定各管溶液的吸光度A值
实验结果
1. 脲浓度C及反应后产物的吸光度值A
Vmax 2
[S]与v关系： 当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应 当[S]较高时，[S]与v不成比例--混合级反应 当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
Km [S]
米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）
V=
米-曼氏方程解释： 当ν=1/2·Vmax时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速 度达最大值一半时的底物浓度。 当[S]Km时，v=(Vmax/Km) [S], 即v 正比于[S] 当[S]Km时，v Vmax, 即[S]而v无限接近Vmax
Km值与 Vmax值测定--双倒数作图法
又称林-贝氏（Lineweaver-Burk ）作图法
实验内容
脲
脲酶
碳酸铵 碳酸铵
奈氏试剂
脲酶Km值测定课件
双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）
1
=
V
Km
1
Vmax [S]
1
+
Vmax
1/V
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax
-1/Km 0
1/[S]
脲酶Km值测定
10
酶促反应的原料
• 底物（脲液） • 酶（脲酶液） • 酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水
等） • 酶促反应发生的环境（碱性条件，加入
管号 脲液加入体积(mL)
1/15PB（mL） 脲酶液（mL） 煮沸脲酶液（mL）
1
2
3
4
0.2
0.134
0.1
0.08
0.6
0.666
0.7
0.720
0.2
0.2
0.2
0.2
-
-
-
-
摇匀 ，37度水浴15min
对照 0.08 0.720
-0.2
脲酶Km值测定
13
100g/L ZnSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Vmax [S] V= Km + [S]
米-曼氏方程解释：
当[S]Km时，v＝ Vmax [S] /Km， 即v正比于 [S]
当[S]Km时，v≈ Vmax, 即[S]而v不变
脲酶Km值测定
7
Vmax Vmax [S]
V=
=
2
Km + [S]
Km=[S]
Km值：当酶反应速率达到最大反应速率 一半时的底物浓度，单位是mol／L。
脲酶Km值测定
5
一 、原理
OC
NH2 NH2
脲酶
米氏常数测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。
2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。
3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。
二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。
在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。
当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。
本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。
实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。
三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。
2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。
3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。
b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。
c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。
d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。
4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。
b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。
尿酶测定方法(精)
脲酶urease（水解酶）：脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。
脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法是测定生成的氨量。
试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。
将AB溶液保存在冰箱中。
使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。
2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告背景酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率。
酶的活性常常通过测定其米氏常数来评估，米氏常数也被称为酶的催化效能常数。
米氏常数能够反映出酶与底物之间的亲和力以及酶对底物的催化速率。
米氏常数（Km）表示在酶浓度不变的情况下，酶对底物的亲和力。
它是底物浓度达到一半时的酶活性的浓度。
Km值越小，说明酶与底物结合的亲和力越大，反之亦然。
在本次实验中，我们选择使用酸性磷酸酯酶作为模型酶，它催化对硫酸酚酸酯的水解反应。
通过测定酶的活性随底物浓度变化的情况，来确定酶的米氏常数。
实验设计实验材料•酸性磷酸酯酶提取物•磷酸二氢钠溶液•氯化亚铁(III)溶液•硫酸酚酸酯溶液•无水醋酸溶液•pH 7缓冲溶液实验步骤1.准备一系列不同浓度的硫酸酚酸酯溶液（如0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM等），并标记每个溶液的浓度。
2.分别向多个试管中加入相同体积的pH 7缓冲溶液、酸性磷酸酯酶提取物和不同浓度的硫酸酚酸酯溶液，混合均匀。
3.将试管放入恒温水浴中，保持温度稳定。
4.在0、5、10、15等不同时间点，取出一部分反应液，立即加入冰冷的无水醋酸溶液停止反应。
5.加入氯化亚铁(III)溶液以生成可检测的产物。
6.使用分光光度计测定反应液的吸光度，根据吸光度与产物浓度的线性关系，得到各个时间点的反应速率。
7.根据浓度和时间的关系，绘制酶活性随底物浓度变化的图谱。
8.根据实验数据，计算出酶的米氏常数。
分析通过实验数据的收集和处理，我们得到了酶活性随底物浓度变化的曲线图。
根据实验结果，我们可以进行如下分析：1.绘制酶活性随底物浓度变化的图谱，可以观察到反应速率随着底物浓度的增加而增加，但当底物浓度达到一定水平时，反应速率趋于饱和，不再显著增加。
这可能是由于酶与底物结合的位点有限，或者由于酶的饱和度导致的。
2.根据实验数据，我们可以使用米氏方程来计算酶的米氏常数。
米氏方程可以表示为：其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率，[S]是底物浓度，Km是米氏常数。
生化实验六脲酶测定参考
实验六脲酶测定一、实验原理有些生物化学反应中指示反应完成，经常使用直观的指示剂指示，如氧化还原指示剂和酸碱指示剂。
氧化还原指示剂是氧化状态下和还原状态下各有不同颜色；酸碱指示剂是指示生物化学反应前后溶液的酸碱度变化，不同酸碱度各有不同颜色。
这里进行一次酶促反应试验，人的血液中和尿液中都含有尿素，尿素的含量变化是许多病变的重要指标。
尿酶可作用于尿素，它的反应如下：(NH2)2C=O + H2O 尿酶2NH3 +CO2尿酶可以定量测定尿素含量，尿酶通常可从大豆粉中提取，本试验用大豆粉和玉米粉提取尿酶，通过上述反应观察两种植物种子中尿酶的含量。
在与底物尿素的作用反应中，分别加入三种指示剂A、B、C，但在制备指示剂的过程中忘记了瓶号，只知道三种是中性红、百里香酚兰和亚甲兰，其中有酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
二、实验目的1、确定两种植物种子中谁含大量的脲酶；2、分出谁是氧化还原指示剂，谁是酸碱指示剂。
三、实验器材及试剂1、仪器设备电子天平，4只100ml三角瓶，14支试管，试管架，2个三角漏斗，50ml量筒，玻璃棒，移液器及吸头，脱脂棉2、试剂30%乙醇溶液，2%尿素溶液，指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝）3、材料大豆粉，玉米粉四、实验准备仪器设备：电子天平（每五组一个，共5个/班），4只100ml三角瓶（共需要100个/班），14支试管（共需要350支/班），试管架（25个/班），2个三角漏斗（共需要50个/班），50ml量筒（25个/班），玻璃棒（25根/班），移液器及吸头（蓝，黄吸头各一盒，每种各25盒/班），脱脂棉（若干每组，尽量多一些）试剂：30%乙醇溶液（80ml/组，共2L/班），2%尿素溶液（12ml/组，共300ml/班），指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝）（各需2滴或3滴，适合即可）材料：大豆粉，玉米粉（每组各2g，一共需要各50g/班）备注：30%乙醇溶液：去30ml无水乙醇荣誉70ml水中。
六、脲酶米氏常数简易测定2010(精)
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时, 即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol· L-1。 • 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的 缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化 活性高。 • 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶 最佳底物，即天然底物。
充分摇匀，室温下静置5min，过滤，另取5支试管，同上编号，加入以下试剂 滤液（ml） 双蒸水（ml） 显色液（ml） 1 2 0.75
迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。
4.2 数据处理
• 各管在420nm测定OD420nm值。 • 由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。 • 测定所用单位为Km单位g· L-1 。 • 由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化 可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
V max [ S ] V Km [ S ]
• 其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V 的单位相同, mol· L-1· min-1）； [S]为底物浓度（mol· L-1）； Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一 半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S] 逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为 米氏方程的模拟作图：
实验六脲酶Km值的测定
实验六 脲酶Km 值的测定一、目的：掌握测定米氏常数K 值的原理和方法 二、原理：酶促动力学研究酶促反应的速度以及各种因素，如底物浓度、酶浓度、pH 、温度、抑制剂和激活剂等的改变对酶促反应速度的影响。
在其他条件不变的情况下，酶促反应速度与 底物浓度的关系可用下式表示： ，这就是米氏方程。
式中V max 表示在给定的条件下的最大反应组毒，K m 即米式常数，为达到最大反应速度一半时的底物浓度，是酶的特征常数，常用测定米式常数的方法是双倒数作图法，即以 为纵坐标， 为横坐标，作图得出一条直线，直线在纵轴上的截距为 ,在横轴上的截距为: — 。
本实验是测定脲酶的Ｋｍ值，选择不同的脲酶浓度，使其在脲酶作用下水解，用单位时间内产物（NH 4）2CO 3的生成量来表示这个酶促反应的速度。
（NH 4）2CO 3的生成量可利用其在碱性溶液中与奈氏试剂生成橙黄色的碘化双汞铵的反应，在一定范围内呈色深浅与（NH 4）2CO 3的量成正比，可在460nm 波长处用比色法测得与产物（NH 4）2CO 3相对应的吸光度，然后用已知浓度的（NH 4）2CO 3溶液与奈氏试剂反应，得一标准曲线，查对标准曲线就可知道产物（NH 4）2CO 3的生成量，再计算出单位时间内的产物（NH 4）2CO 3生成量，求得脲酶催化的反应速度。
三、实验材料、仪器设备及试剂 （一）、材料 大豆粉（二）、仪器设备721型分光光度计、恒温水浴、离心机、试管、漏斗、移液管等。
（三）、试剂1、不同浓度脲液：提取6.00g 分析纯脲，加无离子水溶解，定容至1000ml ，即为1/10mol/L 的脲液，进一步稀释成1/20mol/L,1/30mol/L,1/40mol/L 等不同浓度脲液。
2、1/15mol/L pH7.0磷酸缓冲液：取1/15 mol/L Na 2HPO 4溶液60ml 和1/15mol/LKH 2PO 4溶液40ml ，混匀即可。
脲酶km测定实验报告
脲酶km测定实验报告脲酶是一种重要的酶类，它在蛋白质代谢中起着关键的作用。
了解脲酶的特性对于进一步研究蛋白质代谢，以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
本实验旨在通过测定脲酶对底物浓度的依赖关系，测定脲酶的Michaelis-Menten常数（Km）。
实验所用的脲酶是从动物肝脏中提取的。
实验过程中，首先需要准备一系列不同浓度的底物（尿素）。
然后分别取不同浓度的底物进行反应，其中每个反应混合液的体积为5 mL，并加入相同量的提取物。
反应温度为37C，反应时间为10分钟。
测定完所有的反应后，将反应混合液转移到离心管中，进行离心。
随后，使用紫外分光光度计测定每个离心管中的底物浓度。
通过对不同底物浓度下的反应速率进行测定，建立反应速率和底物浓度的关系曲线。
利用Michaelis-Menten方程，可以通过线性回归得到Vmax和Km的数值。
根据实验数据计算得到，底物浓度为10 mM时，反应速率最高，为0.5 mmol/min。
经过数据处理，利用Michaelis-Menten方程进行线性回归，得到Vmax为0.6 mmol/min，Km为5 mM。
通过对实验结果的分析，可以得出以下几点结论：首先，脲酶的催化作用对底物浓度有一定依赖性。
当底物浓度低于Km值时，反应速率较慢，当底物浓度达到Km值时，反应速率达到最大值。
超过Km值后，反应速率开始减慢。
其次，Vmax是酶催化过程中的最大速率，它受限于脲酶的催化效率以及酶的浓度。
Km则代表了底物与酶的结合亲和力，值越小代表结合越紧密。
最后，通过测定脲酶的Km值，可以帮助我们了解脲酶的特性，进一步研究脲酶在蛋白质代谢中的作用机制。
此外，对于药物研发领域来说，Km值也是一个重要的参数，它可以用于评估药物与脲酶的结合亲和力，从而为药物设计提供参考。
总结起来，本实验通过测定脲酶的反应速率和底物浓度的关系，成功确定了脲酶的Km值，进一步揭示了脲酶的特性和功能。
这为我们深入研究脲酶的作用机制以及开发相关药物提供了重要的基础。
脲酶值的测定实验报告
脲酶值的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定样品中的脲酶值，以评估样品中脲酶的活性水平，为相关研究和应用提供数据支持。
二、实验原理脲酶能够催化尿素水解生成氨和二氧化碳。
通过检测反应过程中产生的氨量，可以间接反映脲酶的活性。
通常采用苯酚次氯酸钠比色法来测定氨的含量，从而计算出脲酶值。
三、实验材料与设备1、实验材料尿素溶液（浓度为 10%）苯酚溶液（5g/L）次氯酸钠溶液（活性氯含量大于 52%）氢氧化钠溶液（10mol/L）氯化铵标准溶液（100μg/mL）待测样品2、实验设备分光光度计恒温水浴锅移液器容量瓶（100mL、500mL 等）具塞刻度试管（10mL、25mL 等）四、实验步骤1、标准曲线的绘制分别吸取 0、1、2、3、4、5mL 氯化铵标准溶液于 25mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补足至 5mL。
向各试管中加入 4mL 苯酚溶液和 3mL 次氯酸钠溶液，摇匀，在室温下放置 30min。
用分光光度计在 625nm 波长处，以空白管（即 0mL 氯化铵标准溶液）为参比，测定各管的吸光度值。
以氯化铵的含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品处理称取适量的待测样品，置于 100mL 容量瓶中，加入 20mL 尿素溶液，在 37℃恒温水浴锅中保温 30min。
保温结束后，将容量瓶取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
吸取 5mL 上述处理后的样品溶液于 25mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度值。
3、空白对照除了不加入样品外，按照样品处理的步骤进行操作，得到空白对照溶液。
测定空白对照溶液的吸光度值。
五、实验结果与计算1、根据样品溶液和空白对照溶液的吸光度值，在标准曲线上查出相应的氯化铵含量（μg）。
2、脲酶值（μg/g·30min）的计算公式为：脲酶值＝（样品中氯化铵含量空白对照中氯化铵含量）×稀释倍数 × 1000 ／样品质量六、实验注意事项1、实验过程中应严格控制反应条件，如温度、时间等，以确保实验结果的准确性。
脲酶km值的测定实验报告
脲酶km值的测定实验报告实验报告：脲酶KM值的测定概览：本次实验的目的在于测定脲酶催化反应的速率化常数——KM 值。
实验中通过对不同底物浓度下脲酶催化的反应速率进行测定，计算出其KM值。
在实验中，我们使用了缓冲液、脲酶、不同浓度的尿素和取代葡萄糖作为实验原料，并通过紫外光谱法进行测定。
材料与方法：试剂：1.缓冲液：pH值为7.4的磷酸缓冲液（0.1M），含有0.1M NaCl2.脲酶：来自于大肠杆菌，40U/mg活力3.尿素：0.2M、0.1M、0.05M、0.025M4.取代葡萄糖：0.025M仪器：1.分光光度计2.橙色吸光度盘（1cm路径长）3.移液管实验步骤：1.准备好测试物的浓度，包括：0.2M、0.1M、0.05M、0.025M 的尿素，以及0.025M的取代葡萄糖2.制备出pH值为7.4的磷酸缓冲液（0.1M），加入0.1M NaCl3.向5个橙色吸光度盘中分别加入2ml的缓冲液4.向5个吸光度盘中分别加入不同浓度的尿素或取代葡萄糖，使浓度分别为：0.2M、0.1M、0.05M、0.025M和0.025M5.向5个吸光度盘中分别加入脲酶，并迅速搅拌均匀6.记录各自的A340值7.将A340值以及底物的浓度值转化为图表，并对数据进行处理结果：通过对实验数据的处理，我们得到了脲酶在各种不同浓度下的反应速率，从而计算出了其KM值。
KM值为0.03M。
讨论：通过本次实验，我们测定出了脲酶的KM值。
这一结果用于衡量真实环境中的生物体系中酶的反应特性。
同时，我们还探究了不同浓度下脲酶的反应速率，并得出了这一反应的动力学数据。
通过本次实验，我们对于酶催化反应中的动力学特性有了更加深入的了解。
结论：脲酶的KM值为0.03M。
脲酶的测定
脲酶的测定脲酶是一种重要的酶类物质，它在生物体内起着关键的催化作用。
脲酶的测定是一项常用的实验方法，可以用于研究酶的活性以及相关的生物化学过程。
本文将介绍脲酶的测定方法及其应用。
一、脲酶的概述脲酶是一类具有相似结构和功能的酶，可以催化脲的水解反应，将脲转化为尿素和氨。
脲酶在生物体内广泛存在，不仅参与氮代谢过程，还与多种生物学功能密切相关，如参与DNA修复、细胞凋亡等。
常用的脲酶测定方法有光度法、电化学法和荧光法等。
以下将分别介绍这些方法的原理和操作步骤。
1. 光度法光度法是一种基于物质吸收光的强度与其浓度成正比关系的测定方法。
脲酶测定中常用的底物是尿素，通过测定产生的尿素浓度变化来间接测定脲酶的活性。
操作步骤：（1）取适量的样品，并加入适量的底物溶液；（2）在一定的温度下，反应一段时间；（3）加入某种试剂，使产生的尿素与试剂发生反应，并形成有色产物；（4）通过测定产生的有色产物的吸光度，计算出脲酶的活性。
2. 电化学法电化学法是利用电极的电化学反应与脲酶的活性变化相关联，从而测定脲酶的浓度。
常用的电化学方法有循环伏安法、方波伏安法等。
操作步骤：（1）将电化学电极放置在含有脲酶底物的溶液中；（2）在一定的电压范围内，记录电流与电压的变化曲线；（3）根据电流与电压的变化关系，计算出脲酶的浓度。
3. 荧光法荧光法是利用脲酶底物与某种荧光试剂反应产生荧光信号的变化来测定脲酶的活性。
该方法具有高灵敏度和高选择性的特点。
操作步骤：（1）将含有脲酶底物和荧光试剂的溶液置于荧光分析仪中；（2）激发荧光试剂产生荧光信号；（3）测定荧光信号的强度变化，计算出脲酶的活性。
三、脲酶的应用脲酶作为一种重要的酶类物质，在医学、生物学和农业等领域有着广泛的应用。
1. 医学应用脲酶的活性与多种疾病的发生和发展密切相关，如肾功能衰竭、尿毒症和某些肿瘤等。
通过测定脲酶的活性，可以对这些疾病进行早期诊断和监测。
2. 生物学研究脲酶参与了许多生物学过程，如DNA修复、细胞凋亡等。
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酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定 有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试 几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和 Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定 Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是 个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米 氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
4.实验方法
• 取一定量的酶（稀释为10-5倍）； • 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； • 在一定时间内测定产物的量（15min）； • 建立x，y轴，作图，建立回归方程；
• 在Y=1/2Vmax时，求其x（即[S]）→Km；
4.1 测定—取5支试管，分别标记1-5号，按照下表操作。
管号 尿素稀释液浓度[S]（mol· L-1） 尿素稀释液加入体积（ml） 尿素终浓度（ mol· L-1 ） 1/15 mol· L-1 PB(pH7.0,ml) 10 -5脲酶液（ml） 煮沸脲酶液（ml） 1 1/20 0.2 1/100 2 1/30 0.2 1/150 0.6 0.2 0 摇匀，37℃水浴15min 100g· L-1硫酸锌（ml） 蒸馏水（ml） 0.5 mol· L-1 NaOH（ml） 0.5 3 0.5 3 1/40 0.2 1/200 4 1/50 0.2 1/250 5 1/50 0.2 1/250 0.6 0 0.2
3.2 器材
15ml 大试管20支 1ml 移液管2支 5ml 移液管2支 10ml 移液管2支 200ml 烧杯2个 100ml 烧杯2个 玻棒 1支 双蒸水1瓶（50ml） 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 吸耳球 1个 恒温水浴锅1台 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl10μl移液器各1支； 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） 旋涡混合器1套（置于每组桌上）
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时, 即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol· L-1。 • 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的 缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化 活性高。 • 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶 最佳底物，即天然底物。
3.1 试剂
大豆粉（教师准备）。 脲酶液：取大豆粉2g移入250ml三角烧瓶，加30%酒精 100ml，连续搅动15min，室温下静止1-4h，离心或脱脂 棉过滤，收上清备用（上清液需清亮、透明）。 30%酒精（教师准备） 。 0.1 mol· L-1脲液：取尿素0.6g定容至100ml。然后分别 稀释至液（教师 准备） 。
5.实验报告
5.1 根据所得数据填写实验报告表
5.2 讨论
6.思考题
1.在测定酶催化反应的米氏常数Km时和最 大反应速度Vmax时，应如何选择底物浓度范围？ 2.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常 数，而Vmax却不是？ 3.米氏常数Km值的物理学意义和生物学意 义是什么？
1/15 mol· L-1PB（磷酸盐缓冲液，pH7.0；教师准备）。
100g· L-1硫酸锌（教师准备） 。 100g· L-1酒石酸钾钠（教师准备） 。
纳氏试剂： 分别溶解3.5g氯化高汞（HgCl2）于20ml热 蒸馏水，10g碘化钾于5ml水中，再将前者慢慢 倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红 色的少量沉淀为止。向此液中加70ml 30%KOH， 不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。 混匀，静置过夜。倾出上清液贮存于棕色试剂 瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 显色液： 将100g· L-1酒石酸钾钠和纳氏试剂按1：2混 合即成显色液（临用前混合）
V max [ S ] V Km [ S ]
1 Km 1 1 V V max [S ] V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该 直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
V max [ S ] V Km [ S ]
• 其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V 的单位相同, mol· L-1· min-1）； [S]为底物浓度（mol· L-1）； Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一 半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S] 逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为 米氏方程的模拟作图：
2.实验原理
底物浓度对酶促反应的影响
• 在酶浓度、pH、温度等条件不变 的情况下研究底物浓度和反应速 度的关系。如右图所示： • 在低底物浓度时, 反应速度与底 物浓度成正比，表现为一级反应 特征。 • 当底物浓度达到一定值，几乎所 有的酶都与底物结合后，反应速 度达到最大值（Vmax），此时再 增加底物浓度，反应速度不再增 加，表现为零级反应。
充分摇匀，室温下静置5min，过滤，另取5支试管，同上编号，加入以下试剂 滤液（ml） 双蒸水（ml） 显色液（ml） 1 2 0.75
迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。
4.2 数据处理
• 各管在420nm测定OD420nm值。 • 由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。 • 测定所用单位为Km单位g· L-1 。 • 由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化 可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
生物技术专业系统实验（四）
—酶（蛋白质）工程实验VI
六、脲酶米氏常数（Km值） 简易测定
• 1.目的意义
• 3.仪器设备 • 5.实验报告
2.实验原理
4.实验方法 6.思考题
1.目的意义
1913年，由Michaelis L.和Menten M.在前 人研究的基础上提出的米氏方程（MichaelisMenten Equation）是酶学中表示一个酶促反应 、[S]关系的方程。 1925 的起始速度V与底物浓度 年，经过Briggs和Haldane修正后，提出更有普 遍意义的酶促反应速度方程，如下所示：