六、脲酶米氏常数简易测定2010(精)

3.2 器材
15ml 大试管20支 1ml 移液管2支 5ml 移液管2支 10ml 移液管2支 200ml 烧杯2个 100ml 烧杯2个 玻棒 1支 双蒸水1瓶（50ml） 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 吸耳球 1个 恒温水浴锅1台 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl10μl移液器各1支； 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） 旋涡混合器1套（置于每组桌上）
充分摇匀，室温下静置5min，过滤，另取5支试管，同上编号，加入以下试剂 滤液（ml） 双蒸水（ml） 显色液（ml） 1 2 0.75
迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。
4.2 数据处理
• 各管在420nm测定OD420nm值。 • 由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。 • 测定所用单位为Km单位g· L-1 。 • 由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化 可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
2.实验原理
底物浓度对酶促反应的影响
• 在酶浓度、pH、温度等条件不变 的情况下研究底物浓度和反应速 度的关系。如右图所示： • 在低底物浓度时, 反应速度与底 物浓度成正比，表现为一级反应 特征。 • 当底物浓度达到一定值，几乎所 有的酶都与底物结合后，反应速 度达到最大值（Vmax），此时再 增加底物浓度，反应速度不再增 加，表现为零级反应。
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定 有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试 几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和 Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定 Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是 个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米 氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
生物技术专业系统实验（四）
—酶（蛋白质）工程实验VI
六、脲酶米氏常数（Km值） 简易测定
• 1.目的意义
• 3.仪器设备 • 5.实验报告
2.实验原理
4.实验方法 6.思考题
1.目的意义
1913年，由Michaelis L.和Menten M.在前 人研究的基础上提出的米氏方程（MichaelisMenten Equation）是酶学中表示一个酶促反应 、[S]关系的方程。 1925 的起始速度V与底物浓度 年，经过Briggs和Haldane修正后，提出更有普 遍意义的酶促反应速度方程，如下所示：
3.1 试剂
大豆粉（教师准备）。 脲酶液：取大豆粉2g移入250ml三角烧瓶，加30%酒精 100ml，连续搅动15min，室温下静止1-4h，离心或脱脂 棉过滤，收上清备用（上清液需清亮、透明）。 30%酒精（教师准备） 。 0.1 mol· L-1脲液：取尿素0.6g定容至100ml。然后分别 稀释至1/20、1/30、1/40、1/50 mol· L-1系列液（教师 准备） 。
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时, 即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol· L-1。 • 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的 缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化 活性高。 • 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶 最佳底物，即天然底物。
1/15 mol· L-1PB（磷酸盐缓冲液，pH7.0；教师准备）。
100g· L-1硫酸锌（教师准备） 。 100g· L-1酒石酸钾钠（教师准备） 。
纳氏试剂： 分别溶解3.5g氯化高汞（HgCl2）于20ml热 蒸馏水，10g碘化钾于5ml水中，再将前者慢慢 倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红 色的少量沉淀为止。向此液中加70ml 30%KOH， 不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。 混匀，静置过夜。倾出上清液贮存于棕色试剂 瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 显色液： 将100g· L-1酒石酸钾钠和纳氏试剂按1：2混 合即成显色液（临用前混合）
V max [ S ] V Km [ S ]
1 Km 1 1 V V max [S ] V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该 直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
5.实验报告
5.1 根据所得数据填写实验报告表
5.2 讨论
6.思考题
1.在测定酶催化反应的米氏常数Km时和最 大反应速度Vmax时，应如何选择底物浓度范围？ 2.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常 数，而Vmax却不是？ 3.米氏常数Km值的物理学意义和生物学意 义是什么？
V max [ S ] V Km [ S ]
源自文库
• 其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V 的单位相同, mol· L-1· min-1）； [S]为底物浓度（mol· L-1）； Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一 半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S] 逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为 米氏方程的模拟作图：
4.实验方法
• 取一定量的酶（稀释为10-5倍）； • 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； • 在一定时间内测定产物的量（15min）； • 建立x，y轴，作图，建立回归方程；
• 在Y=1/2Vmax时，求其x（即[S]）→Km；
4.1 测定—取5支试管，分别标记1-5号，按照下表操作。
管号 尿素稀释液浓度[S]（mol· L-1） 尿素稀释液加入体积（ml） 尿素终浓度（ mol· L-1 ） 1/15 mol· L-1 PB(pH7.0,ml) 10 -5脲酶液（ml） 煮沸脲酶液（ml） 1 1/20 0.2 1/100 2 1/30 0.2 1/150 0.6 0.2 0 摇匀，37℃水浴15min 100g· L-1硫酸锌（ml） 蒸馏水（ml） 0.5 mol· L-1 NaOH（ml） 0.5 3 0.5 3 1/40 0.2 1/200 4 1/50 0.2 1/250 5 1/50 0.2 1/250 0.6 0 0.2