常用免疫组织化学染色方法
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
免疫组织化学染色技术
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法)
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法) 免疫组织化学染色诊断是一种常用于病理学研究和临床诊断的技术，可以通过对组织切片中的特定抗原进行染色，来确定细胞或组织中的特定蛋白质分子的存在、分布和表达水平。
液盖膜涡流混匀法是一种常用的免疫组织化学染色方法，其基本步骤如下：
1. 组织标本的制备：取得需要检测的组织标本，经过处理后制备成切片。
2. 抗原解析：将切片进行抗原解析处理，使得目标蛋白质在切片上暴露出来。
3. 抗体处理：将特异性抗体添加到切片上，并进行孵育，使得抗体和目标蛋白质结合形成免疫复合物。
4. 二级抗体处理：添加与特异性抗体结合的二级抗体，并进行孵育，使得二级抗体与特异性抗体结合。
5. 染色处理：使用染色剂进行染色处理，使得免疫复合物能够被可视化。
6. 直接涡流混匀：将液盖膜盖在切片上，使用混匀仪进行混匀。
该方法主要优点是操作简便、染色效果较好、敏感性和特异性高等，适用于多种组织和细胞的检测。
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常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。
2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。
4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7.PBS冲洗，5分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9.PBS冲洗，5分钟×3次。
10.显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，封片。
12.冰冻切片免疫组化染色步骤。
13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分
钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
【原创实用版】
目录
1.免疫组织化学染色的概念和原理
2.免疫组织化学染色的方法和步骤
3.免疫组织化学染色的应用和案例
4.免疫组织化学染色的发展趋势和前景
正文
一、免疫组织化学染色的概念和原理
免疫组织化学染色是一种通过抗原抗体反应的原理，检测组织切片中特定抗原的表达情况，并将其染色显示出来的技术。
这种技术广泛应用于疾病诊断、病情监测、疾病研究等领域。
二、免疫组织化学染色的方法和步骤
免疫组织化学染色的方法主要包括 LSAB 法和 SP 法。
这两种方法的步骤大致相似，主要包括切片处理、抗原修复、抗体孵育、复合物孵育、染色和核染色等。
1.切片处理：包括切片脱蜡至水、H2O2 甲醇处理切片、水洗等。
2.抗原修复：通过加热或化学方法，使组织切片中的抗原得到修复。
3.抗体孵育：将特异性抗体与组织切片孵育，使其与抗原结合。
4.复合物孵育：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
5.染色：加入染色剂，如 DAB-H2O2，使免疫复合物呈现颜色。
6.核染色：用苏木素等染料染色，使细胞核呈现颜色。
三、免疫组织化学染色的应用和案例
免疫组织化学染色在临床诊断、疾病研究、肿瘤生物学等领域有着广泛的应用。
例如，通过免疫组织化学染色可以检测肿瘤组织中的癌基因、肿瘤标志物等，帮助医生诊断病情、制定治疗方案。
四、免疫组织化学染色的发展趋势和前景
随着科学技术的发展，免疫组织化学染色技术也在不断发展和完善。
免疫组织化学常用方法大全.pdf
● HRP/POD（辣根过氧化物酶）
显色原理：
HRP + H2O2 体）
HRP ·H2O2 + 供氢体 （电子供
型）
HRP + H2O + 供氢体 （氧化
DAB（二氢基联苯胺） 棕褐色 AEC（3-氢-9-乙基咔唑） 红色 TMB（四甲基联苯氨） 深蓝色
● ALP/AP（碱性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 发色团：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT
6. ABC复合物， 45 min 7. PBS洗涤 5 min × 3次 8. 显色（H2O2/DAB）、复染、封片 9. 观察、记录
second antibody-biotin + Avidin + biotinHRP
ABC复合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10μg/ml biotin 2.5μg/ml 临用前30分钟配制
一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ）
生物素标记的第二抗体与链霉菌 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。
操作步骤： ● 石蜡切片，脱蜡至水； ● 过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过
氧化酶的活性； ● 第一抗体； ● 生物素标记的第二抗体； ● 链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液； ● 显色、复染、封片、观察。
基本原理与操作步骤
第一节 免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫组织化学中 最常用的方法，它是在抗原抗体特异反 应存在的前提条件下，借助于酶细胞化 学手段，检测某种物质（抗原／抗体） 在组织细胞内的存在部位。即预先将抗 体与酶连结（酶标抗体），再使其与组 织内特异性抗原反应，经细胞化学染色 后，在光镜或电镜下观察分析。
免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色方法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，通过特定的染色反应可将该蛋白质定位于细胞或组织的特定位置。
免疫组织化学染色方法有多种类型，其中最常用的是免疫荧光染色和免疫酶标记染色。
免疫荧光染色利用荧光标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用荧光显微镜。
免疫酶标记染色利用酶标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用光学显微镜。
免疫组织化学染色方法在病理学、生物学、医学等领域中得到广泛应用，可以用于诊断疾病、研究生物学机制等方面。
该方法具有高特异性、高灵敏度、高分辨率等优点，但也存在某些局限性，如可能出现假阳性或假阴性结果、技术要求较高等。
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gfap染色原理
gfap染色原理GFAP染色是一种常用的免疫组织化学染色方法，用于检测和研究胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。
GFAP是胶质细胞中的一种主要蛋白质，主要存在于星形胶质细胞中，是一种特异的标记物，可以用于识别和定位星形胶质细胞。
GFAP染色的原理是利用免疫反应的特异性，通过特定抗体与GFAP 发生特异性结合，再将抗原抗体复合物与染色剂发生反应，从而得到可视化的染色结果。
该方法可以通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色等不同的技术手段来实现。
在GFAP染色过程中，需要将组织切片进行固定、脱水和脱蜡处理，以保持细胞和组织的完整性。
接着，将切片进行抗原修复处理，以使抗原暴露出来，增强抗体结合的效果。
然后，将抗体与GFAP结合，通过特异性抗原-抗体反应形成复合物。
接下来，可以选择直接可视化染色或者使用辅助试剂，例如酶标记二抗、荧光标记二抗等，将染色结果可视化。
GFAP染色可以提供关于星形胶质细胞的丰富信息。
正常情况下，GFAP主要存在于星形胶质细胞的胞质和胶质纤维中，通过GFAP 染色可以观察到星形胶质细胞的形态、分布和数量。
在神经系统疾病中，星形胶质细胞的形态和数量可能会发生变化，GFAP染色可以帮助鉴定星形胶质细胞的异常表达，从而提供疾病诊断和治疗的依据。
GFAP染色在神经科学研究中具有广泛的应用。
例如，在研究神经发育过程中，GFAP染色可以帮助观察星形胶质细胞的分化和成熟过程。
在研究神经退行性疾病时，GFAP染色可以观察到星形胶质细胞的激活和病理变化。
此外，GFAP染色还可以用于评估神经系统损伤的程度和恢复过程。
GFAP染色是一种重要的实验技术，通过检测和研究GFAP可以提供有关星形胶质细胞的信息。
它在神经科学研究和神经疾病诊断中具有重要作用，为科学家和医生提供了对神经系统功能和病理变化的深入了解。
随着技术的不断发展和改进，GFAP染色将在未来的研究和临床实践中发挥更重要的作用。
免疫组织化学染色诊断标本
免疫组织化学染色诊断标本
免疫组织化学染色是一种常用的诊断手段，可以通过特定抗体与组织标本中的特定分子结合，从而揭示组织中的病理变化和疾病的诊断。
常见的免疫组织化学染色标本包括：
1. 组织切片：通过组织切片可以观察组织结构和细胞排列情况，并进行免疫组织化学染色以检测特定蛋白或分子的表达情况。
2. 血液标本：血液标本可以用于免疫组织化学染色，例如对血液中的细胞进行表面抗原的检测，用于诊断血液系统相关的疾病。
3. 涂片：涂片一般采用刮取或刷取方式收集组织或细胞，然后涂在载玻片上，用于检查炎症、癌变等情况。
4. 空洞液体：空洞液体标本可以用于免疫组织化学染色，例如腹水、胸水等。
通过检测液体中特定蛋白的表达情况，可以辅助诊断液体积聚的原因。
5. 组织脱落细胞：组织脱落细胞可以通过涂片或细胞块的方式收集，用于诊断癌症等疾病。
免疫组织化学染色标本的选择取决于具体的疾病类型和需要检测的蛋白或分子。
免疫组织化学染色 诊断
免疫组织化学染色诊断1.什么是免疫组织化学染色免疫组织化学染色是一种在组织中检测特定分子的方法。
它基于抗体-抗原反应的原理，利用免疫抗原识别的能力快速、定量地确定组织中特定分子的分布与数量。
免疫组织化学染色的主要原理是使用特异性抗体识别并定位组织中感兴趣的分子。
2.免疫组织化学染色的应用领域免疫组织化学染色在医学领域中应用广泛。
它可用于确定细胞或组织中某些蛋白质或抗原的存在、缺失或异常表达等。
此外，它还可以帮助诊断和治疗许多疾病，例如癌症、免疫疾病、感染、自身免疫性疾病等。
免疫组织化学染色可用于检测癌细胞、病毒感染等，从而识别疾病类型、病情严重程度和转移潜力。
同时，它还被广泛应用于生物技术研究和仿生医学领域，如蛋白质研究、药物研发等。
3.免疫组织化学染色的常见方法目前，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫荧光染色、酶测定法、免疫过氧化物酶染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色等。
4.免疫组织化学染色的基本步骤（1）样本制备：组织样品必须经过切片及染色前的某些处理，如切片、脱水和透明化等。
（2）抗原预处理：为了增强抗体与抗原之间的结合力，必须对组织样品进行预处理。
有许多方法可用于抗原的加热、固定和破裂处理。
（3）抗体处理：抗体是免疫组织化学染色的关键。
它必须与病理组织中的目标抗原特异性结合。
（4）检测染色：检测染色是用于检测所需分子或细胞在组织中分布情况的关键步骤。
检测染色一般可用荧光染色、酶标记染色、过氧化物酶染色等技术。
5.免疫组织化学染色与其他组织化学染色方法的比较相对于传统的组织学和病理学染色方法，免疫组织化学染色具有以下优点：（1）稳定性更好：传统组织学染色易受外部因素影响而导致失真。
而免疫组织化学染色具有更好的稳定性和可靠性。
（2）分辨率更高：免疫染色可以通过选择抗体来检测复杂的具有高度分子异质性的生物标志物分子。
（3）特异性更强：传统组织学染色往往无法区分细胞和组织中的细微差别，而免疫组织化学染色可以通过选择特异性较强的抗体来识别和区分不同的细胞或组织。
免疫组化sp法
免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。
相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。
本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。
原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。
HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。
而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。
SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。
实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。
可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。
2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。
使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。
3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。
4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。
5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。
根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。
6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。
在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。
7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。
AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。
8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。
9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。
实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。
2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。
免疫组化抗体选择及常用染色方法
免疫组化抗体选择及常用染色方法一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
二、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
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常用免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质
的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生
物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色
方法介绍：
1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：
免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使
用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色
方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗
原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：
免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度
特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互
作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复
合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：
免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位
特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显
微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异
性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：
免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的
抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过
氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色
底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：
免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
它能够同时检测细胞中的特定mRNA和蛋白质表达，可以用于研究基因表
达调控、细胞特异性、发育过程和肿瘤等方面。
综上所述，免疫组织化学染色方法在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过这些方法，可以对生物样本中特定蛋白质的表达和定位进行研究。
不
同的染色方法具有各自的优缺点，选择适合的方法可以更好地满足研究需要。
此外，不断改进和创新免疫组织化学染色方法也为生物医学研究提供
了更多的可能性。