10基因治疗
基因治疗PPT课件
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
基因治疗
基因治疗基因治疗是指向受体细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以利用引入基因以杀死体内的病原体或恶性细胞。
基因工程的兴起，使得基因治疗成为可能。
一些目前尚无有效治疗手段的疾病，如遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆及爱滋病等，可望通过基因治疗来达到防治的目的。
下面是基因治疗的几个例子。
1. 复合免疫缺陷综合征的基因治疗：1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。
采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素2（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。
大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，未见明显副作用。
此后又进行第2例治疗获得类似的效果。
2. 黑色素瘤的基因治疗：对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。
于1992年实施了TNF／肿瘤细胞和IL－2／肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子（TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90％的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。
由于携有TNF的TIL 可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。
3. 其它遗传病的基因治疗：其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。
对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。
例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。
基因治疗(生物化学)
基因载体的构建 使目的基因在受体细胞内高效、可控、 稳定地表达 受体细胞选择 易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。
如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞
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基因转移(gene transfer)方法
1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移
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1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导基因转移效率较高 据统计，有72%的临床实验计划和71%的病 例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转
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基因增补（gene augmentation）
定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。
类型: 有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内 的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的 表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
整合
反 转 录 病 毒 载体
腺病毒载体
致病性
可能致病
感染细胞
分裂细胞
克隆容量
<7kb
随机整合，效率 高
不整合，可能丢 失
不致病
分裂细胞、非 分裂细胞
<7.5kb <5kb
腺相关病毒载 体
定点整合(19号染
色体特定区域)
不致病
分裂细胞、非 分裂细胞
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2.非病毒载体介导的基因转移系统
（1）脂质体介导的基因转移技术 使用方便、成本低廉。 基本原理: 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋 外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细 胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内， 并进行表达。
素；
– 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。
基因治疗
与安全性相联系的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的 动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特征的变化世代相传， 将给人类带来的是福还是祸。
概念
狭义概念
广义概念
狭义概念
指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
广义概念
基因治疗指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。
主要分类
按靶细胞
按基因操作
给药途径
按基因操作
基因治疗一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序 列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基 因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除 异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或 转录，以达到抑制某些异常基因表达。
①ex vivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞 扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大， 不容易推广；
②in vivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或 非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫 排斥及安全性等一系列问题。
基因治疗的例子
基因治疗的例子基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
它通过将正常的基因导入患者的体内，修复或替代缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。
以下是基因治疗的十个例子：1. 囊性纤维化治疗：囊性纤维化是一种常见的遗传性疾病，基因治疗可以通过将正常的CFTR基因导入患者体内来修复缺陷基因，从而恢复肺部和胰腺的正常功能。
2. 血友病治疗：血友病是一种由于凝血因子缺乏导致的出血性疾病，基因治疗可以通过导入正常的凝血因子基因来恢复凝血功能，从而治疗血友病。
3. 巨细胞病毒感染治疗：巨细胞病毒感染是一种常见的病毒感染，基因治疗可以通过导入抗病毒基因来增强机体对巨细胞病毒的抵抗能力，从而治疗感染。
4. 癌症治疗：基因治疗在癌症治疗中有广泛的应用。
例如，通过导入抑制癌细胞生长的基因，可以抑制癌细胞的增殖，达到治疗癌症的效果。
5. 心血管疾病治疗：基因治疗可以通过导入修复心脏血管的基因来治疗心血管疾病。
例如，通过导入血管生成因子基因，可以促进新血管的生成，改善心脏供血情况。
6. 免疫缺陷病治疗：免疫缺陷病是一类免疫系统功能异常的疾病，基因治疗可以通过导入正常的免疫相关基因来增强免疫功能，从而治疗免疫缺陷病。
7. 遗传性视网膜病治疗：遗传性视网膜病是一类导致视网膜退化的疾病，基因治疗可以通过导入修复视网膜功能的基因来治疗视网膜病，恢复视力。
8. 先天性免疫缺陷病治疗：先天性免疫缺陷病是一类由于先天基因缺陷导致的免疫系统功能异常的疾病，基因治疗可以通过导入正常的免疫相关基因来修复免疫功能，从而治疗先天性免疫缺陷病。
9. 神经退行性疾病治疗：神经退行性疾病是一类由于神经细胞退化导致的疾病，基因治疗可以通过导入促进神经细胞生长和修复的基因来治疗神经退行性疾病，延缓疾病进展。
10. 遗传性代谢病治疗：遗传性代谢病是一类由于代谢酶缺乏或功能异常导致的疾病，基因治疗可以通过导入正常的代谢酶基因来修复代谢功能，从而治疗遗传性代谢病。
基因诊断与基因治疗
（1）DNA模板的变性 DNA模板的变性 模板的
将待扩增DNA加热到95 左右，使双链DNA DNA解开成 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成 DNA加热到
使模板DNA或延伸后的双链DNA DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热 技术在模板、dNTP、 等条件下， 技术在模板 Taq酶代替DNA聚合酶 用合成的DNA引物代替RNA 酶代替DNA聚合酶， DNA引物代替RNA引 的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引 经过DNA变性、引物与模板结合 复性）和延伸3 DNA变性 模板结合（ 物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可 个循环），目的DNA 个步骤的循环过程（25∼30个循环），目的DNA可扩增 100万倍以上 万倍以上。 100万倍以上。
并游离于反应体系中作为模板； 并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性） 模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 左右） 将体系温度降至合适温度 （ 550C 左右 ） ， 使加入 的引物与模板DNA两端 碱基序列互补结合。 的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 DNA两端（
固 相 支 持 物
B
本法优点： 本法优点：
16 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
situ） （6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA RNA序列 DNA或 序列。 进而检测特异的DNA或RNA序列。 有 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 三类杂交
基因治疗的原理和临床应用
基因治疗的原理和临床应用近年来，随着生物学和医学的不断发展，基因治疗作为一种新颖的治疗手段，受到越来越多的关注。
它通过直接作用于基因，改良基因序列或者控制基因表达，从而达到治疗疾病的目的。
本文将介绍基因治疗的原理和临床应用。
一、基因治疗的原理基因治疗是利用DNA、RNA等核酸对病变基因进行干预和纠正，或者提高其生物活性等治疗手段。
它主要分为三类：基因替换、基因修饰、基因靶向治疗。
1.基因替换基因替换是指将正常基因导入体内，取代患有病变基因的功能，从而矫正导致患病的异常生理和生化现象。
其中典型的例子是囊性纤维化。
该疾病是由一种缺陷的基因(CFTR基因)引起的，导致黏液不能被有效地分泌，最终引发肺部和胰腺的严重疾病。
为了治愈这种疾病，基因治疗的主要策略是将CFTR基因通过特定的载体体系导入到患者的细胞内。
载体是一种可以帮助患者或患者体内的细胞摆脱从外部进入它们的CFTR缺失的大分子碳水化合物黏液的物质。
研究人员将CFTR基因注入这些载体后，将其与人体细胞结合，利用人体细胞的功能将这些复合物递送到囊性纤维化患者的组织和细胞中，从而取代CFTR基因的功能。
这种技术目前仍在临床试验阶段，但已经给予了许多病人新的希望。
2.基因修饰基因修饰是指修改患有病变基因序列中的DNA，以纠正基因缺陷。
其主要方法包括：1)基因靶向的核酸序列的编辑技术: CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技术是一种新兵的基因修饰技术，可删除、更新、修复和修改基因序列等多种操作，可以清除细胞级别的病变，是目前最常用和最流行的基因修饰技术之一，CRISPR技术通过导入CRISPR-Cas9复合体，使其靶向基因切断，利用细胞内自身的DNA修复系统完成基因缺陷修复。
2)裂解与合成技术(antisense Technology)该技术旨在识别疾病基因所编码的mRNA序列，并将其引入人体内，以靶向裂解 mRNA的方式减少该基因的表达。
3)单核苷酸多态性技术(SNP)SNP是指在同一个基因的同一位点上，常规基因和变异基因仅在一个碱基上不同。
基因治疗
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略
直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法
基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。
基因治疗临床试验概述
基因治疗临床试验概述基因疗法从被发明应用，到如今的蓬勃发展，其进程可谓一波三折。
随着越来越多基因治疗产品上市，基因治疗的征程已获得里程碑性胜利。
从目前已获批产品和未获批的产品临床试验进程来看，基因治疗具有广阔前景。
近日，发表在BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY上题为Gene th erapy clinical trials, where do we go? An overview的综述中，作者简要回顾了基因治疗的历史，总结了目前基因治疗的主要领域及涉及的临床试验。
基因治疗的发展历史基因治疗的历史可以分为基础研究、临床实验开始、萧条到繁荣以及未来的发展这四个阶段。
下文将对每个阶段的时间及发生的主要事件进行详述。
1.1 基础研究阶段（1909-1973）基因治疗之旅始于Wilhelm Johannsen创造了“基因（gene）”一词。
Francis Crick和James Watson在大约半个世纪后发现了DN A双螺旋结构。
“基因工程（genetic engineering）”一词最早是在20世纪30年代开始使用。
在20世纪60年代，人们发现了细菌中基因转移的基本原理，并根据这些原理发展了真核细胞的基因转移技术。
20世纪70年代首次描述的限制性内切酶和连接酶构成了基因操作的基础。
重组DNA技术使研究人员能够将选定的治疗基因导入工程载体。
随着病毒转移遗传物质的能力被发现，病毒载体逐渐成为一种有前途的基因转移工具。
这些技术进步使科学家成功应用基因治疗载体将特定遗传物质转移到靶细胞从而实现治疗目的。
1.2 临床试验开始阶段（1989-2003）基因治疗临床阶段始于1989年，一种逆转录病毒被应用于新霉素耐药标记，用来追踪黑色素瘤免疫治疗中的浸润性淋巴细胞。
第一次成功的基因治疗临床试验于1990年在宾夕法尼亚大学启动，在一名被诊断为重症联合免疫缺陷病（SCID）的四岁女孩体内应用：该试验使用逆转录病毒载体将正常拷贝的腺苷脱氨酶（ADA）基因转移到患者的T细胞后，令机体产生ADA的能力提高。
白细胞介素-10的免疫双重作用及抗炎应用进展
第59卷 第2期2023年04月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .2A pr i l 2023[收稿日期]2021-03-25; [修订日期]2023-03-31[基金项目]山东省新旧动能转换重大工程重大课题攻关项目(鲁发改重大办[2018]1268号);山东省重大科技创新工程项目(2018C X G C 1404)[第一作者]王贞丽(1971-),女,硕士,副主任药师㊂E -m a i l :q d -w z h e n l i @163.c o m ㊂[通信作者]丁会芹(1987-),女,博士,高级工程师㊂E -m a i l:d i n g h u i q i n @k l t ph a r m.c n ㊂白细胞介素-10的免疫双重作用及抗炎应用进展王贞丽1,秦欢2,王建刚3,丁会芹2,3(1 中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心质量管理科,山东青岛 266071;2 青岛大学基础医学院;3 康立泰生物医药(青岛)有限公司)[摘要] 白细胞介素-10(I L -10)是抗炎细胞因子,近年来,大量研究显示I L -10兼具免疫刺激和免疫抑制的双重作用㊂本文分析了I L -10发挥双重免疫调节作用的机制与主要抗炎作用通路,综述了I L -10在炎性疾病中的治疗潜力及I L -10的药物开发方向㊂[关键词] 白细胞介素10;免疫调节;炎症;基因治疗[中图分类号] R 979.5 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)02-0313-04d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.061[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s 2/d e t a i l /37.1517.R.20230522.1154.011.h t m l ;2023-05-23 17:09:07A D V A N C E S I NT H ED U A LI MM U N O R E G U L A T O R YR O L EO FI N T E R L E U K I N -10A N DI T SA P P L I C A T I O NI N A N T I -I N F L A M -M A T I O N WA N GZ h e n l i ,Q I N H u a n ,WA N GJ i a n g a n g ,D I N G H u i qi n (Q u a l i t y M a n a g e m e n tS e c t i o no fQ i n g d a oS p e c i a l S e r v i c eS a n a t o r i u m C e n t e r o f P L A N a v y ,Q i n gd a o 266071,C h i n a )[A B S T R A C T ] I n te r l e u k i n -10(I L -10)i s a na n t i -i nf l a mm a t o r y c y t o k i n e ,a n d i n r e c e n t y e a r s ,a l a r gen u m b e r o f s t u d i e sh a v e s h o w n t h a t I L -10h a s t h e d u a l r o l e o f i mm u n o s t i m u l a t i o n a n d i mm u n o s u p p r e s s i o n .T h i s a r t i c l e a n a l yz e s t h em e c h a n i s mo f t h e d u a l i mm u n o r e g u l a t o r y r o l e o f I L -10a n d t h em a i n a n t i -i n f l a mm a t o r y p a t h w a y s o f I L -10a n d r e v i e w s t h e t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f I L -10i n i n f l a mm a t o r y d i s e a s e s a n d t h e f u t u r e d i r e c t i o n f o r d r u g d e v e l o pm e n t .[K E Y W O R D S ] i n t e r l e u k i n -10;i mm u n o m o d u l a t i o n ;i n f l a mm a t i o n ;g e n e t i c t h e r a p y30年前,人们首次发现白细胞介素-10(I L -10),认为其是T h 2细胞分泌的标志性细胞因子㊂在I L -10发现初期,人们便证明它可以抑制T h 1细胞产生炎性细胞因子[1],以及通过下调主要组织相容性复合体Ⅱ(MH C -Ⅱ)抑制单核细胞的抗原递呈能力,从而阻止T 细胞特异性增殖[2]㊂但随着研究的深入,人们逐渐发现I L -10不仅具有抗炎的免疫抑制作用,同时又有免疫刺激作用,这可能是阻碍I L -10临床应用的重要原因㊂本文通过对I L -10免疫双重作用的分析及抗炎作用的机制研究进展进行综述,分析I L -10抗炎方面的治疗潜力,旨在为I L -10抗炎作用的临床应用和药物开发提供参考依据㊂1 I L -10结构与来源I L -10是由两个非共价键结合的单体组成的同型二聚体分子,分子量约36000,每个单体由160个氨基酸组成,在单体之间存在两个二硫键连接㊂I L -10主要由活化的T 细胞㊁单核细胞㊁巨噬细胞㊁树突状细胞㊁自然杀伤细胞和B 细胞分泌,其中T 细胞是I L -10的主要来源[3]㊂值得注意的是,近年来研究显示,一些非造血细胞(如上皮细胞)也能够产生I L -10,当内源性和外源性递质(例如脂多糖㊁儿茶酚胺和c AM P 升高药物)激活这些细胞时,I L -10就会释放出来[4]㊂2 I L -10在免疫反应中的双重作用及影响因素早先的研究认为,I L -10的主要作用是抑制炎症反应㊂然而,近些年的研究结果却表明I L -10可能存在免疫双重作用,即在某些情况下促进炎症反应的发生而非抗炎,这一作用可能是阻碍I L -10在炎症性疾病中应用的原因之一㊂例如,R E N N I C K 等[5]研究发现,I L -10缺陷型小鼠自发性发展为炎症性肠病(I B D ),体内产生大量促炎细胞因子;而过表达I L -10的小鼠可以抵抗葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎,这表明内源性I L -10能够预防I B D 的发生㊂此外,I L -10在胰腺炎[6]㊁糖尿病[7]㊁脓毒症[8]动物模型中均表现出了抑制炎症作用㊂然而临床研究结果却与预期相反,给予重组人源I L -10(r h I L -10)病人临床症状并没有显著地改善,且疗效在病人间存在较大差异,r h I L -10对疾病严重程度高㊁内源性I L -10血清水平低病人的疗效高于疾病严重程度低㊁I L -10血清水平高的病人[9];此外,低至中剂量的r h I L -10给药可改善病人临床症状,而高剂量r h I L -10全身给药促进疾病进展,这与血清促炎细胞因子水平升高有关[10]㊂以上研究结果提示,I L -10的免疫双重作用取决于炎症程度和I L -10剂量,此外还与靶细胞类型㊁免疫反应阶段等有关系㊂2.1 I L -10作用于不同靶细胞介导不同的免疫效应I L -10在免疫系统中的作用可以分为固有免疫与适应性免疫两个方面㊂在固有免疫中I L -10作用于抗原递呈细胞Copyright ©博看网. All Rights Reserved.314青岛大学学报(医学版)59卷(A P C s),主要诱导免疫抑制反应㊂A P C s如巨噬细胞(Mø)和树突状细胞(D C s)表达高水平的I L-10受体(I L-10R),并在激活后进一步上调其表达[11],A P C s中I L-10信号通路的一般功能是维持免疫稳态,抑制促炎反应㊂因此,在固有免疫中I L-10发挥抗炎作用㊂而适应性免疫中I L-10发挥免疫双重作用,这取决于T 细胞的异质性㊂T细胞主要参与适应性免疫,不同于A P C s 本身高表达I L-10R,T细胞一般在激活后才上调I L-10R,即在幼稚T细胞中表达最低,在记忆T细胞中表达最高[12]㊂因此,I L-10影响T细胞在不同炎症阶段的功能㊂一方面, I L-10在炎症过程中直接抑制C D4+T细胞亚群的促炎效应[13]㊂F o x p3高表达的C D4+T细胞是重要的促炎细胞,其表面表达C D40L蛋白,能够激活B细胞从而促进炎症的发生[14]㊂此外I L-10还可影响F o x p3+调节性T细胞(F o x p3+ T r e g)的稳定性,抑制炎症的发生㊂而1型调节T(T R1)细胞是一类F o x p3低表达的C D4+T细胞,其特征是表达多种共抑制受体(L A G-3㊁T I M-3㊁P D-1㊁C T L A-4㊁T I G I T)但不表达C D40L,研究发现I L-10能促进T R1细胞的稳定性和功能,发挥抗炎作用[15]㊂此外,I L-10还能够抑制T h17细胞的分化[16]㊂另一方面,I L-10调控C D8+T细胞可能发挥相反的效应,肿瘤内C D8+T细胞经I L-10诱导后释放I F N-γ和颗粒酶/穿孔素,I F N-γ一般可促进炎症,但也有报道认为其与I L-10可能在免疫抑制中起协同抗炎作用;另外,I L-10还刺激C D8+T细胞的细胞毒性功能以及记忆免疫的形成,发挥促炎作用[17]㊂2.2 T细胞中I L-10的浓度与功能的关系在健康志愿者体内进行的I L-10临床试验显示,在脂多糖(L P S)诱导内毒素血症的情况下,高剂量的r h I L-10除了能够抑制A P C s和C D4+T细胞活化外,还可诱导细胞毒性C D8+T细胞活化[18]㊂提示I L-10的双重功能不仅依赖于靶细胞,还依赖于I L-10的浓度,即A P C s和C D4+T细胞在低浓度和高浓度I L-10水平时均可以被控制,而C D8+T细胞则需要高浓度I L-10才能被激活㊂但是I L-10在什么情况下激活相同靶细胞(如C D8+T细胞㊁T h1细胞和T h17细胞)的促炎或抗炎信号还需要进一步的研究㊂此外,I L-10的细胞来源和辅助因子(如其他细胞因子)是否会影响I L-10的双重功能尚不清楚㊂在肿瘤治疗研究方面,N A I N G等[19]选择晚期实体瘤病人作为研究对象,聚乙二醇修饰的I L-10(P E G-I L-10)以1~ 40μg/k g剂量每日一次皮下给药,研究药物安全性和耐受性,结果表明P E G-I L-10可激活全身免疫反应,免疫刺激细胞因子升高,血清中转化生长因子β降低,其中1例葡萄膜黑色素瘤病人和4例肾细胞癌病人以20μg/k g剂量治疗8周后病情缓解㊂而在炎症性疾病的研究方面,F E D O R A K 等[20]应用r h I L-10(1~20μg/k g)治疗轻度至中度活动性克罗恩病病人,结果显示5μg/k g剂量的治疗效果最佳㊂此外T I L G等[21]研究显示,应用20μg/k g剂量r h I L-10皮下注射治疗克罗恩病会导致病人血清I F N-γ水平升高,不仅没有观察到对克罗恩病的临床疗效,反而观察到发热㊁头痛等副作用㊂以上结果提示低剂量I L-10可抑制C D4+T细胞发挥抗炎作用,用于治疗炎症疾病;而高剂量I L-10可诱导C D8+T 细胞活化,抗炎作用减弱,但可用于抗肿瘤治疗㊂3I L-10抗炎作用相关级联通路I L-10作用于靶细胞后发生何种反应取决于细胞表面I L-10R的参与和细胞内的信号级联[22]㊂I L-10R由α㊁β两个亚基组成,I L-10Rα主要表达于白细胞,与I L-10高亲和性结合,而I L-10Rβ则是广泛表达的,与I L-10辅助性结合㊂与I L-10Rα亚单位相关的J a n u s激酶(J A K)和与I L-10Rβ亚单位相关的酪氨酸激酶(T Y K)在I L-10的作用下发生磷酸化,然后激活信号转导蛋白和转录激活蛋白(S T A T s)同源/异源二聚化并移位到细胞核中,进而调节免疫反应,如降低MH C-Ⅱ的表达,减少A P C s分泌促炎细胞因子,以及上调参与调节巨噬细胞失活的肌腱膜纤维肉瘤基因B型蛋白,从而抑制炎性因子的表达㊂研究表明,除经典的J A K-S T A T 级联通路外,I L-10还可以通过激活磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶(P I3K)/A k t级联通路,增强抗凋亡因子B c l-2和B c l-x l的表达,同时降低c a s p a s e-3的表达水平,从而阻止细胞凋亡[23]㊂E D D I E I P等[24]提出了另一条与I L-10代谢有关的机制通路:I L-10抑制L P S诱导的葡萄糖摄取和糖酵解,并促进氧化磷酸化;此外,I L-10通过激活S T A T-D D I T4通路抑制雷帕霉素靶蛋白(m T O R)靶点的活性来控制细胞代谢,并认为I L-10的这种代谢控制对炎症的控制至关重要㊂因此,与其多重来源一样,I L-10也靶向多种细胞和通过多种分子途径来抑制或刺激免疫反应[22]㊂4I L-10的抗炎应用研究进展4.1外源性I L-10蛋白治疗鉴于I L-10具有广泛的抗炎作用,人们首先想到通过应用外源性I L-10治疗疾病,目前已在多种动物模型或临床试验中证实了重组I L-10蛋白对疾病的疗效㊂MA Z E R等[25]通过建立小鼠脓毒症模型研究显示,I L-10一方面抑制单核细胞产生T N F-α,降低炎症反应;另一方面激活适应性免疫促进T细胞产生I F N-γ,激活机体抗感染反应,表明I L-10不论是对先天性免疫的抑制作用还是对适应性免疫系统的刺激作用均对脓毒症具有积极的治疗作用㊂K R I S HN A-MU R T H Y等[26]对小鼠急性心肌梗死模型研究显示,造模后第0㊁1㊁3㊁5㊁7天皮下注射50μg/k g重组I L-10可改善心室功能,减轻心肌纤维化,降低小鼠死亡率㊂HO S等[27]建立了角膜缝线诱导的大鼠角膜新生血管模型,结膜注射小鼠重组I L-10蛋白10μg/L治疗,结果表明I L-10可以抑制炎症反应并抑制血管生成,证明I L-10具有治疗病理性角膜炎的潜力㊂T I N S L E Y等[28]的研究显示,连续向孕鼠腹腔注射r h I L-10可减轻其子痫样症状㊂Z HA O等[29]用不同浓度I L-10处理小鼠视网膜色素上皮细胞(R P E),结果显示I L-10可抑制R E P细胞增殖和迁移,下调炎症因子分泌,表明I L-10Copyright©博看网. All Rights Reserved.2期王贞丽,等.白细胞介素-10的免疫双重作用及抗炎应用进展315具有改善风湿性视网膜脱离的潜力㊂尽管外源性I L-10蛋白治疗在动物实验中表现出了不错的效果,然而在临床试验中却并未表现出良好的疗效㊂原因可能是由于I L-10半衰期短,药代动力学不确定,作用机制复杂,很难通过简单地提供外源性I L-10蛋白来达到临床需求㊂4.2I L-10抗体药物治疗I L-10全身性给药不仅治疗效果不佳,还容易引起不良反应,新的开发策略倾向于I L-10的靶向给药㊂例如,由意大利P h i l o g e n公司开发的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白F8-I L-10(D e k a v i l)就是基于抗体的药物传递策略,由人F8抗体(靶向纤维连接蛋白结构域A)与I L-10融合,能够在疾病部位传递和积累细胞因子,在治疗类风湿性关节炎(R A)和I B D中很有前景[30]㊂F R A N Z等[31]研究显示,F8/I L-10在慢性排斥反应发展过程中有治疗效果㊂G A L E A Z Z I等[32]在临床试验中应用F8/I L-10与甲氨蝶呤联合治疗R A,与安慰剂组相比显示出较好的疗效㊂Q I A O等[33]则开发了基于西妥昔单抗的I L-10融合蛋白,能够延长I L-10半衰期并有助于I L-10肿瘤靶向递送,具有更好的抗肿瘤效果㊂I L-10抗体药物解决了单独使用重组I L-10蛋白给药特异性差的问题,是未来新药开发的一个有效途径㊂4.3I L-10基因治疗基因治疗和基因编辑(基因的功能修饰)代表了人类疾病治疗的未来方向㊂I L-10的基因治疗同样成为了近年来主要的研究方向㊂C Y P E L等[34]在肺移植前使用编码I L-10的腺病毒载体(A d h I L-10)进行基因治疗以修复原发性移植物功能障碍导致的供体肺损伤,结果显示A d h I L-10治疗后肺功能(动脉氧压和肺血管阻力)有显著改善,促炎细胞因子表达向抗炎细胞因子表达转变,肺泡-血液屏障恢复完整性㊂O I S H I等[35]研究也显示,慢病毒I L-10基因疗法增加了肺移植模型小鼠I L-10的表达,具有积极作用㊂为了对抗移植排斥反应,J E O N G等[36]构建了携带巨细胞病毒I L-10(v I L-10)基因重组腺病毒载体,治疗供体大鼠1h后进行皮肤异体移植,结果证明移植物中的v I L-10基因提高了移植物存活率并减少急性排斥反应,证明I L-10基因治疗是预防移植排斥反应的一种有效的免疫抑制方法㊂此外,结肠炎小鼠模型直肠给药编码I L-10的慢病毒载体和腹腔注射编码I L-10的质粒均安全地穿透局部黏膜组织,对小鼠结肠炎有治疗作用[37]㊂将编码h I L-10质粒注入去卵巢大鼠牙龈,能抑制牙槽骨吸收,抑制促炎细胞因子的表达,治疗牙周炎[38]㊂不同于以上研究中直接使用I L-10基因载体,有研究构建了慢病毒C X C L10载体,以C X C L10启动子基因间接调节I L-10的过表达,结果显示R A病人滑膜细胞产生的炎症细胞因子减少,该研究提供了一种适用于R A的诱导型局部基因治疗方法㊂综上所述,I L-10是一种具有抗炎和促炎特性的多效细胞因子,炎症程度㊁I L-10剂量㊁靶细胞类型㊁免疫反应阶段等均可影响I L-10的抗炎效应㊂外源性重组I L-10蛋白已经在众多炎症性疾病动物模型中表现出了良好的药理作用,近年来,随着抗体药物与基因治疗的发展,研究者们开始致力于I L-10融合蛋白药物㊁抗体药物或基因治疗药物的开发㊂本综述聚焦在I L-10免疫调节双重作用的因素与I L-10成药性研究上,旨在为I L-10抗炎药物开发提供参考㊂[参考文献][1]F I O R E N T I N O DF,Z L O T N I K A,MO S MA N N T R,e ta l.I L-10i n h i b i t sc y t o k i n e p r o d u c t i o nb y a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s[J].T h e J o u r n a l o f I mm u n o l o g y,1991,147(11):3815-3822.[2]N E UMA N N C,S C H E F F O L D A,R U T Z S.F u n c t i o n sa n dr e g u l a t i o no fTc e l l-d e r i v e d i n t e r l e u k i n-10[J].S e m i n a r s i n I m-m u n o l o g y,2019,44:101344.[3]WA N GXT,WO N G K,O U Y A N G WJ,e t a l.T a r g e t i n g I L-10f a m i l y c y t o k i n e s f o r t h et r e a t m e n to fh u m a nd i s e a s e s[J].C o l dS p r i n g H a r b o rP e r s p e c t i v e si n B i o l o g y,2019,11(2):a028548.[4]O U Y A N G W J,O G A R R A A.I L-10f a m i l y c y t o k i n e s I L-10a n d I L-22:f r o mb a s ic s c i e n c e t o c l i n i c a l t r a n s l a t i o n[J].I mm u-n i t y,2019,50(4):871-891.[5]R E N N I C K D M,F O R T M M.L e s s o n s f r o m g e n e t i c a l l y e n g i-n e e r e da n i m a lm o d e l s.Ⅻ.I L-10-d e f i c i e n t(I L-10(-/-)m i c ea n d i n t e s t i n a l i n f l a mm a t i o n[J].A m e r i c a n J o u r n a l o fP h y s i o l o-g y G a s t r o i n t e s t i n a la n d L i v e r P h y s i o l o g y,2000,278(6):G829-G833.[6]林荣贵.白介素-10对重症急性胰腺炎大鼠血脑屏障损伤的影响及机制研究[D].福州:福建医科大学,2018.[7]赵辉.过表达I L-10的脂肪间充质干细胞促进糖尿病小鼠慢性创面愈合的研究[D].北京:北京协和医学院,2019. 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基因治疗_10年回顾与中国之发展浅析
0 引言
1 国际基因治疗 10 年回顾
自从 1989 年人类史上首例基因治疗临床试验 方案在美国被批准实施以来 , 到目前为止 , 基因治 疗从实验室走向临床试验已整整 10 年了 。统计显 示 , 截至 1998 年底 , 世界范围内已有 373 个临床 方案被实施 , 累计 3134 人接受了基因转移试验 。 尽管基因治疗仍有许多障碍还有待克服 , 但总的趋 势是令人鼓舞的 , 充分显示了其巨大的开发潜力及 应用前景 。正如基因治疗的奠基者们当初所预言的 那样 , 基因治疗这一新技术的出现将推动下一世纪 医学的革命性变革 。的确 , 作为一种全新的医学生 物学概念与治疗手段 , 基因治疗正在逐步走向临 床 , 并有望于即将来临的 21 世纪初期成为一种安 全 、有效的临床治疗策略而为人们所接受 。
基因治疗(gene therapy)
近年来，更多采用体内方案。重组 逆转录病毒直接注射的途径主要有： 1）采用静脉注射等途径，将重组病 毒直接注射到机体内，通过重组病毒 的感染作用实现基因转移；2）直接 将产生重组逆转录病毒载体的包装细 胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞 释放再感染靶细胞；
3）直接将表达载体，可以是非 病毒性表达质粒，注射到人体内， 如将HIV-1病毒载体注射到肌肉 内，使其表达相应的env基因蛋 白，引起相应的细胞免疫。
定义 把基因转移到患者体内，使其发
挥作用，以达到治疗疾病目的的技 术称为基因治疗(Gene Therapy)。
基因治疗自Anderson于1990年进行 了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA）， 经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞， 经扩增后输回患儿体内，获得了成功。 患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳 性，除了还需应用部分剂量的ADA蛋白外， 其他体征正常。这一成功标记着基因治 疗的时代已经开始。
3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成 员，是一类小的单链DNA病毒（基因组 约4.7kb），非常稳定。本身无致病性， 需辅助病毒（常为AV）存在时才能复 制。AAV可感染人的细胞，并能整合至 非分裂相细胞。
大部分AAV基因组可去除，从而可 使外源基因得以大量补足。AAV可以 整合进入宿主细胞基因组，但不如 RV的整合效率高。有趣的是，在感 染细胞中，野生型AAV基因组可高效 定点整合于人类第19号染色体长臂 的特定位置上，这种整合可导致染 色体基因重排，
5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的
基因以治疗基因表达异常的疾 病。如：以野生型P53基因治疗 肺癌或急性白血病。
6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。
《基因治疗》PPT课件
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
基因治疗PPT课件
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
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基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
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目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
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一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
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❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
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腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
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首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
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基因治疗(概述)PPT
（基四）因基治因疗增的补 策略
又称基因修饰，是指将目的基因导入病变细胞或其他 细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能会使原 有的某些功能得以加强。
在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目 前基因治疗多采用这种方式。
（五基）因基因治干疗扰的策略
又称基因失活，有两种干扰方法： 1、抑制有害的基因表达：导入肿瘤抑制基因， （如rb或 p53),以抑制癌基因的异常表达。 2、封闭有害基因：用反义RNA或小分子干扰RNA来疯币癌基 因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但可用来抑制病原体 的关键基因。
如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后 给予患者无毒性的环氧鸟苷药物。肿瘤细胞被杀死，而对 正常细胞无影响。
基因治一些疗常的见策疾略病的基因治疗策略：
基因治疗
目录
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基因治疗的发展史 基因治疗的概述 基因治疗的策略 基因治疗的方式
问题互动
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基基因因治治疗疗（g的en定e th义erapy）
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因 缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基 因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移 技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制 造的产物能治疗某种疾病。
（基三）因基治因疗激的活 策略
有些正常基因不能表达并发生了基因突变，而是由 于被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有的 是编码区是正常的但调控区发生了突变。
前者可以通过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后 者可以加入正常启动子来激活基因。
但是实现定点去甲基化和乙酰化也非易事；原位修复 调控序列也是很难的。
基因诊断：产生基因缺陷的原因除了进化障碍 因素外，主要包括点突变、缺失、插入、重排 等DNA分子畸变事件的发生。 目前已建立多种病变基因的诊断和定位方法： 如PCR扩增序列法、单链构型多态性分析法、人 类基因库搜寻法等
基因治疗名词解释
基因治疗名词解释基因治疗是一种通过修复、替代或调控患者体内的异常基因来治疗遗传性疾病的方法。
它是一种新兴的生物医学技术，具有重要的临床应用前景。
下面将对一些与基因治疗相关的重要名词进行解释。
1. 基因：基因是生物体内能够传递遗传信息的分子单位，由DNA或RNA组成，是遗传信息的基本单位。
基因决定了生物体的形态、功能和特性。
2. 基因治疗：基因治疗是一种通过修复或调控患者体内异常基因的方法来治疗遗传性疾病。
它可以通过向患者体内导入健康基因、修复异常基因或调控基因表达来达到治疗疾病的目的。
3. 基因修复：基因修复是一种通过修复患者体内异常基因序列的方法，使其恢复正常功能。
这可以通过使用DNA修复酶或基因修复向导RNA介导的修复等技术实现。
4. 基因替代：基因替代是一种通过向患者体内导入健康基因来取代异常基因的方法。
这可以通过使用载体（如病毒载体）将健康基因导入到患者体内，使其表达出正常的功能。
5. 基因调控：基因调控是一种通过调控基因的表达水平来治疗疾病的方法。
通过引入特定的调控基因或RNA干扰技术，可以增强或抑制特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。
6. 基因传递系统：基因传递系统是一种将治疗性基因导入患者体内的载体系统。
它可以是病毒载体、非病毒载体或其他纳米粒子等。
这些载体可以保护基因免受外界环境的损害，并帮助基因在患者体内有效地传递和表达。
7. 基因编辑：基因编辑是一种通过精确修改基因序列来改变基因的功能的技术。
目前常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALEN和ZFN等。
这些技术可以精确地删除、插入或替换目标基因序列，从而实现对基因功能的精确调控。
8. 向量：向量是一种可以携带外源基因并将其导入患者体内的工具。
病毒载体是目前最常用的向量，它可以通过改造病毒基因组并将治疗性基因插入其中，然后将其注射到患者体内，实现基因导入和表达。
9. 转基因：转基因是指通过人为手段将外源基因导入到生物体内，并使其在生物体内表达。
基因治疗策略
基因治疗策略引言基因治疗是一种新兴的、有望为各种遗传性疾病和其他疾病提供潜在治疗方法的技术。
基因治疗的核心目标是通过操纵一个或多个异常基因，修复或替代受损的基因，以恢复细胞或组织的正常功能。
在过去的几十年里，基因治疗在实验室和临床研究中取得了显著的进展，为患者提供了新的治疗方案和希望。
基因治疗的基本原理基因治疗包括三个基本步骤：基因传递、基因表达和基因功能修复。
1.基因传递：基因传递是指将治疗基因导入患者体内的过程。
有多种技术可以完成这一步骤，例如病毒载体介导的基因传递、化学载体介导的基因传递和物理方法介导的基因传递。
其中，病毒载体介导的基因传递是最常用的方法，常用的病毒载体包括腺病毒和逆转录病毒。
2.基因表达：一旦治疗基因被导入细胞内，它需要被转录为RNA并翻译为蛋白质，以发挥治疗效果。
基因表达可以通过多种机制调控，包括启动子、转录因子和启动子增强子等。
3.基因功能修复：治疗基因的功能修复可以通过多种机制实现，例如替代或修复患者体内缺失或缺陷的基因、抑制异常基因的表达、激活孤立基因的表达以及通过基因转移的方式提供新的功能。
基因治疗的策略基因治疗的策略可以根据治疗的目标和方法的不同而有所区别。
下面将介绍几种常见的基因治疗策略：1.基因替代治疗：基因替代治疗是用一个正常的基因替代一个异常的基因，以恢复受损的基因功能。
这种治疗策略常用于单基因遗传性疾病的治疗。
例如，在囊性纤维化患者中，可以将正常的囊性纤维化转膜调节基因导入呼吸道上皮细胞，以恢复其正常功能。
2.基因静默治疗：基因静默治疗是通过利用RNA干扰技术抑制异常基因的表达。
RNA干扰是一种天然的细胞机制，通过小干扰RNA（siRNA）或microRNA（miRNA）的介导，抑制特定基因的表达。
这种策略常用于癌症等疾病的治疗。
3.基因增强治疗：基因增强治疗是通过提高特定基因的表达水平来治疗疾病。
这种策略常用于孤立基因障碍等疾病，在这些疾病中，特定基因的表达水平过低，导致相关功能异常。
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• 怎样将重组DNA导入宿主细胞，并且能在宿
主细胞中有效表达目的蛋白，达到基因治疗的
目的。
1、基因治疗的策略：
1)基因修复(gene reparation)
2)基因代替(gene substitution ) 3)基因抑制( gene inhibition )
4)基因开放(gene opening) 5)基因增强(gene enhancement)
入靶细胞代替遗传缺陷的基因，或关闭、抑制 异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病目的 的一种临床治疗技术。 一句话：将外源性基因引入细胞，以改变细 胞或个体的表型来达到治疗的目的。
1、原理
1) DNA是遗传的物质基础。
2)基因是能表达产生特异蛋白质 的DNA片段。 3)遗传病的根源在于基因异常， 对异常基因的纠正可以使疾病获得 根治。
性的iPS细胞。
iPS 细胞显示了ES细胞的形态学（圆形、 大核仁和少细胞质）和生长特性，表达了 ES细胞的标志基因。
• 通过皮下注射把iPS细胞移植到裸鼠体 内形成了畸胎瘤（包含了来自三个胚 层的各种组织），说明其具有分化多 潜能性。
• 用显微注射的方法把iPS细胞注射到小 鼠胚泡内，iPS细胞参与了胚胎发育， 形成成熟的嵌合体小鼠。
基因表达序列的改变： 单个或多个核苷酸的突变、缺失、重复
基因调控区域的改变：
基因启动子的突变、缺失等
20世纪50年代,DNA双螺旋结构、遗传密码与中
心法则，奠定了基因结构和功能的分子生物学理
论基础。
70年代重组DNA技术的发展，使携带目的基因
的病毒载体在实验室产生。
80年代现代生物学在理论和技术上的突破，使基 因治疗成为可能。
Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector.
Kay MA, Manno CS, Ragni MV, Larson PJ, Couto LB, McClelland A, Glader B, Chew AJ, Tai SJ, Herzog RW, Arruda V, Johnson F, Scallan C, Skarsgard E, Flake AW, High KA.
• 病毒载体的安全性
• 基因治疗的审批与临床试验 • 美国是最早开展基因治疗的国家 • 先在地方伦理小组---HGTS----RAC---FDA
• 1989年首例基因标记与基因治疗，恶性黑色
素瘤
• 1990年首例成功案例，ADA-SCID
• 1999年患难事件，杰辛格事件---OTC
二、基因转移系统
(1)裸DNA直接注射
（1）裸DNA直接注射
（2）基因枪（gene gun)
（3）电穿孔法（electroporation）
电 转
（4）显微注射(microinjection)
2、基因转移的化学方法
（1）磷酸钙共沉淀法
（2）DEAE-葡聚糖转染法
（3）脂质体转染法
（4）纳米颗粒转移法
（1）磷酸钙共沉淀法
直接体内法(in vivo)
间接体内法（ex vivo)
基因转移的方法可分为：Fra bibliotekgene-transferring strategies
物理 physical； 化学 chemical； 生物 biochemical。
1、基因转移的物理方法
基因转移的物理方法包括：
裸DNA直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射等
糖尿病
• 血友病B： • 一种X连锁遗传的出血性疾病，由 FIX的缺乏而出现严重的凝血功能障碍。
在男性中该病的发病率1/30000，临床特
征为关节和软组织的自发性出血。
• 正常人体内，FIX的浓度为5ug/ml，根 据血浆中FIX的水平，可以将血友病B分 为三类： • 重型 低于正常浓度的1% • 中间型 低于正常浓度的5% • 轻型 低于正常浓度的20%
以超过或代替异常基因的表达。
基因增强：
是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达 产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。
2、 基因转移的方法
基因转移是基因治疗的关键和基础，实施 基因转移的途径主要有两类： 1）直接体内法(in vivo) ，即活体直接转移 法，指将外源基因直接注入人体内有关组织器 官，使其进入相应的细胞 2）间接体内法（ex vivo) ，即在体转移，指 在体外将外源基因导入细胞，再将这种细胞回 输到病人体内。
纳米颗粒（nanoparticle)
3、基因转移的生物学方法
主要分为两类： 1）病毒介导的基因转移 • 逆转录病毒（RV）载体 • 腺病毒（Ad）载体 • 腺相关病毒（AAV）载体 • 单纯疱疹病毒（HSV）载体 • 多种形式的嵌合病毒载体
逆转录病毒（RV） 载体(Vector)
腺相关病毒（AAV）载体
后来科研人员用Oct3/4, Sox2, 和 Klf4 三个基因组合以及OCT4, SOX2, NANOG, 和LIN28四个基因组合把人 皮肤成纤维细胞成功诱导为iPS细胞， 同时待诱导的细胞也由成纤维细胞扩大 到胃上皮细胞、肝细胞等细胞。
为了评价iPS细胞的治疗性潜能，美国科学家Jacob Hanna等做了用自体成纤维细胞诱导出的iPS治疗镰 状细胞性贫血症小鼠模型的动物实验。 治疗策略： 1.将突变体小鼠体内成纤维细胞诱导成iPS细胞； 2.通过同源重组修复有遗传缺陷的iPS细胞； 3.体外把修复的iPS细胞诱导分化成HPs（造血祖细
• 国际首次血友病基因治疗临床研究是我 国的复旦大学遗传研究所与上海长海医 院血液科合作开展的。 • 病人皮肤细胞，重组反转录病毒，注射 入病人皮下。
• Kay进行的重组AAV直接肌肉注射法临 床基因治疗研究。
Nat Genet 2000 Mar;24(3):257-61
Comment in: •Nat Genet. 2000 Mar;24(3):201-2.
• FIX基因： • 定位在X染色体上，全长33.5Kb，由8个 外显子、7个内含子；c DNA全长2.8kb，
编码序列为1383bp，编码461个氨基酸，
成熟FIX蛋白为415氨基酸。在肝脏中特异
表达，蛋白加工后，以分泌途径从肝细胞释
放到血液。
• 血友病B的基因治疗的临床前研究
• 通过病毒载体介导的in vivo和ex vivo基因转移 系统的途径实现。 • 采用的宿主细胞：肝细胞、肌细胞和成纤维细胞。 • 基因转移的载体：病毒载体。
胞）；
4.把这些HPs移植到经辐射照射的供体小鼠体内。
实验比较成功，达到了预期的治疗效果，显示了iPS 细胞用于遗传病基因治疗的巨大潜力。
三 临床应用例子(Examples of clinical application)
血友病B（hemophilia B) 重症联合免疫缺陷症 (Severe Combined Immunodeficiency , SCID） β-地中海贫血
• X连锁的重症联合免疫缺陷（X-SCID） • T、B淋巴细胞功能先天性缺乏综合征，1/80000。
• 发病机制：
• 1、 细胞因子受体γ 链缺陷 • 2、Jak3缺陷 • 3、X-SCID中T细胞和NK细胞发育缺陷 • 4、Jak-STAT途径中其他环节对T细胞和NK细胞的 影响
• X-SCID的基因治疗：
“自杀”基因疗法
• iPS细胞（人工诱导的多潜能干细胞）
最先由日本京都大学Yamanaka科研团队发起这项研究， 他们选择Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4四个基因， 通过逆转录病毒将这四个基因导入小鼠胚胎成纤维细胞 和小鼠成体成纤维细胞中，可以引起待诱导细胞的基因
组发生重新编程而转变为具有ES细胞（胚胎干细胞）特
导，虽有点疗效，但有其局限性
• 细胞水平的研究:
• 病毒载体介导的人珠蛋白基因转移，骨 髓干、祖细胞。 • RNA/DNA嵌合体介导的定点修复
• 间接体内(ex vivo)基因转移研究
• RV重组体，受体鼠骨髓中，----有效。
• AAV 用于间接体内珠蛋白基因转移的报道很 少。 • HIV 研究活跃，动物实验中取得了好的结果。
非病毒性生物载体法 配体/受体 非生物性载体法 脂质体，微粒子， GAM
非载体法
质粒DNA注射、吸入， 电穿孔法，显微注射， 体内电穿孔，基因疫 磷酸钙共沉淀法 苗
基因治疗的靶细胞
• • • • • • 造血干细胞 肝细胞 肌细胞 淋巴细胞 皮肤成纤维细胞 iPS细胞（ induced pluripotent stem cell）
• 反转录病毒载体介导的FIX基因转移，采用部分
肝脏切除，转染的效率不高，不能达到治疗的目
的。
• 腺病毒介导的FIX基因转移，效果在鼠体内维持 了较长时间，但在狗体内维持的时间较短。 • 腺相关病毒介导的FIX基因转移，取得了重要的 发展，临床基因治疗也获得了初步的成功。
• 血友病B基因治疗临床研究
基因修复：原位修复有缺陷的基因，使其在质和量上均能得
到正常的表达。
基因代替：指去除整个变异基因，用有功能的正常基因
取代之，使疾病基因得到永久的更正。
基因抑制：利用反义RNA抑制有害基因的表达
基因开放
β - 珠蛋白基因家族（11号染色体）：
ε Aγ Gγ ψβ δ β
drug
基因开放：目的在于促使有类似功能的基因表达，
• 糖尿病的基因治疗
• 胰岛细胞中胰岛素的表达调控、生物合 成与分泌。 • 胰岛素分泌的工程化细胞株的建立。
胰岛β-细胞系的工程化 胰岛干细胞操作 非β-细胞系的工程化