10基因治疗

基因表达序列的改变： 单个或多个核苷酸的突变、缺失、重复
基因调控区域的改变：
基因启动子的突变、缺失等
20世纪50年代,DNA双螺旋结构、遗传密码与中
心法则，奠定了基因结构和功能的分子Baidu Nhomakorabea物学理
论基础。
70年代重组DNA技术的发展，使携带目的基因
的病毒载体在实验室产生。
80年代现代生物学在理论和技术上的突破，使基 因治疗成为可能。
• 病毒载体的安全性
• 基因治疗的审批与临床试验 • 美国是最早开展基因治疗的国家 • 先在地方伦理小组---HGTS----RAC---FDA
• 1989年首例基因标记与基因治疗，恶性黑色
素瘤
• 1990年首例成功案例，ADA-SCID
• 1999年患难事件，杰辛格事件---OTC
二、基因转移系统
入靶细胞代替遗传缺陷的基因，或关闭、抑制 异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病目的 的一种临床治疗技术。 一句话：将外源性基因引入细胞，以改变细 胞或个体的表型来达到治疗的目的。
1、原理
1) DNA是遗传的物质基础。
2)基因是能表达产生特异蛋白质 的DNA片段。 3)遗传病的根源在于基因异常， 对异常基因的纠正可以使疾病获得 根治。
直接体内法(in vivo)
间接体内法（ex vivo)
基因转移的方法可分为：
gene-transferring strategies
物理 physical； 化学 chemical； 生物 biochemical。
1、基因转移的物理方法
基因转移的物理方法包括：
裸DNA直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射等
• 糖尿病的基因治疗
• 胰岛细胞中胰岛素的表达调控、生物合 成与分泌。 • 胰岛素分泌的工程化细胞株的建立。
胰岛β-细胞系的工程化 胰岛干细胞操作 非β-细胞系的工程化
四、恶性肿瘤的基因治疗
• • • • • 细胞因子导入疗法 自杀基因疗法 肿瘤抑制基因疗法 耐药基因疗法 其他疗法：反义基因疗法
• 临床前的研究 • RV介导的γc基因转移能纠正细胞的发育缺陷。 • 临床研究
• 法国Fisher领导的实验室，用RV 转染淋巴细
胞后，回输入病人体内。
• β-地中海贫血
• 是一种常见的遗传病，国内主要是以广东、广
西、云南和四川等，按症状可分为轻型、中型
和重型。
• 传统的治疗方法是以输血、骨髓移植和药物诱
非病毒性生物载体法 配体/受体 非生物性载体法 脂质体，微粒子， GAM
非载体法
质粒DNA注射、吸入， 电穿孔法，显微注射， 体内电穿孔，基因疫 磷酸钙共沉淀法 苗
基因治疗的靶细胞
• • • • • • 造血干细胞 肝细胞 肌细胞 淋巴细胞 皮肤成纤维细胞 iPS细胞（ induced pluripotent stem cell）
• X连锁的重症联合免疫缺陷（X-SCID） • T、B淋巴细胞功能先天性缺乏综合征，1/80000。
• 发病机制：
• 1、 细胞因子受体γ 链缺陷 • 2、Jak3缺陷 • 3、X-SCID中T细胞和NK细胞发育缺陷 • 4、Jak-STAT途径中其他环节对T细胞和NK细胞的 影响
• X-SCID的基因治疗：
• FIX基因： • 定位在X染色体上，全长33.5Kb，由8个 外显子、7个内含子；c DNA全长2.8kb，
编码序列为1383bp，编码461个氨基酸，
成熟FIX蛋白为415氨基酸。在肝脏中特异
表达，蛋白加工后，以分泌途径从肝细胞释
放到血液。
• 血友病B的基因治疗的临床前研究
• 通过病毒载体介导的in vivo和ex vivo基因转移 系统的途径实现。 • 采用的宿主细胞：肝细胞、肌细胞和成纤维细胞。 • 基因转移的载体：病毒载体。
基因治疗
Gene Therapy
医学遗传学国家重点实验室
National Key Laboratory of Medical Genetics
.
（1）概述 （2）基因转移系统
（3）临床例子
（4）肿瘤的基因治疗 （5）基因治疗存在的问题
概述
基因治疗的定义
基因治疗 （gene therapy)是指将正常基因植
糖尿病
• 血友病B： • 一种X连锁遗传的出血性疾病，由 FIX的缺乏而出现严重的凝血功能障碍。
在男性中该病的发病率1/30000，临床特
征为关节和软组织的自发性出血。
• 正常人体内，FIX的浓度为5ug/ml，根 据血浆中FIX的水平，可以将血友病B分 为三类： • 重型 低于正常浓度的1% • 中间型 低于正常浓度的5% • 轻型 低于正常浓度的20%
Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector.
Kay MA, Manno CS, Ragni MV, Larson PJ, Couto LB, McClelland A, Glader B, Chew AJ, Tai SJ, Herzog RW, Arruda V, Johnson F, Scallan C, Skarsgard E, Flake AW, High KA.
• 1980年，Cline等采用磷酸钙介导的基
因转移系统治疗地中海贫血，未能成功。 • 基础工作的重要，主要是 基因转移与表 达调控，探讨目的基因在受体细胞或整 体动物中的整合特点、表达水平与调控 规律。并且疾病的基因治疗必须视不同 疾病而异。
• 基因治疗作为现代医疗史上的充满着很 大希望和潜在风险的现代高新技术，因 此伦理学和安全性的讨论有其必要性与 超前性。 • 目的性 基因转移的受体细胞
以超过或代替异常基因的表达。
基因增强：
是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达 产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。
2、 基因转移的方法
基因转移是基因治疗的关键和基础，实施 基因转移的途径主要有两类： 1）直接体内法(in vivo) ，即活体直接转移 法，指将外源基因直接注入人体内有关组织器 官，使其进入相应的细胞 2）间接体内法（ex vivo) ，即在体转移，指 在体外将外源基因导入细胞，再将这种细胞回 输到病人体内。
3、基因转移的生物学方法
2）非病毒载体介导的基因转移
配体/受体 人工染色体
配体/受体 （ligand/receptor)
基因转移方法
病毒载体法
直接体内法 (in vivo)
RV,HIV，AV,AAV, HSV，poxrivus
间接体内法 (ex vivo)
RV,HIV，AV,AAV, HSV,poxrivus Mt,MAC,HAC,HMC 脂质体，微粒子， GAM
• 国际首次血友病基因治疗临床研究是我 国的复旦大学遗传研究所与上海长海医 院血液科合作开展的。 • 病人皮肤细胞，重组反转录病毒，注射 入病人皮下。
• Kay进行的重组AAV直接肌肉注射法临 床基因治疗研究。
Nat Genet 2000 Mar;24(3):257-61
Comment in: •Nat Genet. 2000 Mar;24(3):201-2.
CaCl2,DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即 有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以 吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将 DNA吸收进入细胞质而后进入细胞核 DNA 多以拷贝首位相连的串珠状排列进入细 胞，在细胞中多以多拷贝形式存在。 瞬间表达效率最高可达20%,长期表达效率低。
（2）DEAE-葡聚糖转染法
• 二乙胺乙基葡聚糖（diethyl-aminoethyldextran,DEAE-dextran)是一种高分子量的多 聚阴离子试剂
• 能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA
• 该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他
DNA
• 适合于细胞瞬间表达检测及小量DNA的转染。
(3)脂质体（liposome)
纳米颗粒（
• iPS细胞（人工诱导的多潜能干细胞）
最先由日本京都大学Yamanaka科研团队发起这项研究， 他们选择Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4四个基因， 通过逆转录病毒将这四个基因导入小鼠胚胎成纤维细胞 和小鼠成体成纤维细胞中，可以引起待诱导细胞的基因
组发生重新编程而转变为具有ES细胞（胚胎干细胞）特
纳米颗粒（nanoparticle)
3、基因转移的生物学方法
主要分为两类： 1）病毒介导的基因转移 • 逆转录病毒（RV）载体 • 腺病毒（Ad）载体 • 腺相关病毒（AAV）载体 • 单纯疱疹病毒（HSV）载体 • 多种形式的嵌合病毒载体
逆转录病毒（RV） 载体(Vector)
腺相关病毒（AAV）载体
• 怎样将重组DNA导入宿主细胞，并且能在宿
主细胞中有效表达目的蛋白，达到基因治疗的
目的。
1、基因治疗的策略：
1)基因修复(gene reparation)
2)基因代替(gene substitution ) 3)基因抑制( gene inhibition )
4)基因开放(gene opening) 5)基因增强(gene enhancement)
(1)裸DNA直接注射
（1）裸DNA直接注射
（2）基因枪（gene gun)
（3）电穿孔法（electroporation）
电 转
（4）显微注射(microinjection)
2、基因转移的化学方法
（1）磷酸钙共沉淀法
（2）DEAE-葡聚糖转染法
（3）脂质体转染法
（4）纳米颗粒转移法
（1）磷酸钙共沉淀法
导，虽有点疗效，但有其局限性
• 细胞水平的研究:
• 病毒载体介导的人珠蛋白基因转移，骨 髓干、祖细胞。 • RNA/DNA嵌合体介导的定点修复
• 间接体内(ex vivo)基因转移研究
• RV重组体，受体鼠骨髓中，----有效。
• AAV 用于间接体内珠蛋白基因转移的报道很 少。 • HIV 研究活跃，动物实验中取得了好的结果。
胞）；
4.把这些HPs移植到经辐射照射的供体小鼠体内。
实验比较成功，达到了预期的治疗效果，显示了iPS 细胞用于遗传病基因治疗的巨大潜力。
三 临床应用例子(Examples of clinical application)
血友病B（hemophilia B) 重症联合免疫缺陷症 (Severe Combined Immunodeficiency , SCID） β-地中海贫血
性的iPS细胞。
iPS 细胞显示了ES细胞的形态学（圆形、 大核仁和少细胞质）和生长特性，表达了 ES细胞的标志基因。
• 通过皮下注射把iPS细胞移植到裸鼠体 内形成了畸胎瘤（包含了来自三个胚 层的各种组织），说明其具有分化多 潜能性。
• 用显微注射的方法把iPS细胞注射到小 鼠胚泡内，iPS细胞参与了胚胎发育， 形成成熟的嵌合体小鼠。
基因修复：原位修复有缺陷的基因，使其在质和量上均能得
到正常的表达。
基因代替：指去除整个变异基因，用有功能的正常基因
取代之，使疾病基因得到永久的更正。
基因抑制：利用反义RNA抑制有害基因的表达
基因开放
β - 珠蛋白基因家族（11号染色体）：
ε Aγ Gγ ψβ δ β
drug
基因开放：目的在于促使有类似功能的基因表达，
后来科研人员用Oct3/4, Sox2, 和 Klf4 三个基因组合以及OCT4, SOX2, NANOG, 和LIN28四个基因组合把人 皮肤成纤维细胞成功诱导为iPS细胞， 同时待诱导的细胞也由成纤维细胞扩大 到胃上皮细胞、肝细胞等细胞。
为了评价iPS细胞的治疗性潜能，美国科学家Jacob Hanna等做了用自体成纤维细胞诱导出的iPS治疗镰 状细胞性贫血症小鼠模型的动物实验。 治疗策略： 1.将突变体小鼠体内成纤维细胞诱导成iPS细胞； 2.通过同源重组修复有遗传缺陷的iPS细胞； 3.体外把修复的iPS细胞诱导分化成HPs（造血祖细
“自杀”基因疗法
• 反转录病毒载体介导的FIX基因转移，采用部分
肝脏切除，转染的效率不高，不能达到治疗的目
的。
• 腺病毒介导的FIX基因转移，效果在鼠体内维持 了较长时间，但在狗体内维持的时间较短。 • 腺相关病毒介导的FIX基因转移，取得了重要的 发展，临床基因治疗也获得了初步的成功。
• 血友病B基因治疗临床研究