第三章 细胞破碎

3.3 细胞壁的破碎
破碎方法的选择： 破碎方法的选择： 破碎目的
待破碎生物体的类型 破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗； 研究胞内产物在体内的功能， 研究胞内产物在体内的功能，宜 采用软处理。 采用软处理。 待破碎生物体的类型： 待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不 同的敏感度（见表3.2 3.2） 同的敏感度（见表3.2）
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
HC23图3.3 HC23-高压细胞 破碎机
图3.4 DY89-1 型电动 玻璃匀浆机
㈡ 高 压 匀 浆 法
作用机理： 作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀 之间的环隙高速(可达到450m s)喷出后撞击 450m／ 之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后， 到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急 剧释放到低压环境， 剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等 综合作用下破碎。 综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常 为50～70MPa。 50～70MPa。
3.2 细胞壁的结构及组成
细胞壁的化学组成： 细胞壁的化学组成： 微生物的类型 年龄 生长生理学
3.2 细胞壁的结构及组成
图3.1 细胞外层结构
3.2 细胞壁的结构及组成
表3.1 各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 壁厚（ ） 壁厚（nm） 层 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母 20～80 ～ 单层 肽聚糖(40~90%) 肽聚糖 多糖 胞壁酸 主要组成 蛋白质 脂多糖 破碎难易程度 难 10～25 ～ 100～300 ～ 多层 多层 肽聚糖(5~10%) 葡聚糖 葡聚糖(30~40%) 肽聚糖 脂蛋白 甘露聚糖 （30％） ％） 脂多糖 磷脂 蛋白质 蛋白质 脂类 最难 相对易
∫
R
0
t dR 1 = ∫ kdt ⇒ Ln = kt Rm − R 0 1− x
... 3.2
其中： ＝ 其中：X＝R/Rm，破碎率
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
影响破碎效率的因素： 影响破碎效率的因素： 转盘外缘速度 细胞浓度 珠粒大小及装载量 温度 流速
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 转盘外缘速度： 转盘外缘速度： 在一定范围内， 在一定范围内，破碎的比速率与外 缘速度成正比
0
) Z] }
β
Z:常数； 临界压力； Z:常数；P：破碎压力；p0：临界压力； 常数 破碎压力； 取决于细胞浓度的参数；R:蛋白质的释放量 β：取决于细胞浓度的参数；R:蛋白质的释放量
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 压力： 压力：
P↑
R↑
T↑
磨损 ↑
能耗 ↑ （每 ↑ 100 MPa，能耗 ↑ 3.5KW）
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
珠粒大小及装载量： 珠粒大小及装载量： 过少不， 过少不，不易破碎 过多，能耗大，热扩散性能降低， 过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高 不利搅拌，一般控制80％～90%. 80％～ ，不利搅拌，一般控制80％～90%. 对细菌，磨珠越 细菌， 小，破碎率越高 ；对酵母和藻类 ，存在最佳范围 实验室： 实验室：0.2mm 工业： 工业：不小于 0.4mm
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 浓度： 浓度： 一般认为，酵母破碎率与细胞浓度无关 一般认为， Doulach等人通过理论分析，认为破碎 Doulach等人通过理论分析， 等人通过理论分析 率与细胞浓度存在下列关系： 率与细胞浓度存在下列关系：
R = 1 − exp − p − p
{ [(
3.1
来自百度文库
x＝R/Rm ＝ N0：原始细胞数 R:破碎后释放的化合物的量 破碎后释放的化合物的量 时间操作后， N：经t时间操作后，保存下来的细胞数 Rm:理论最大释放量 理论最大释放量 的获取： N0 和N的获取： 直接计数法（平板计数，显微镜计数） 直接计数法（平板计数，显微镜计数） 间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量） 间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量） 电导率测定法
上述数字表示相对敏感度， 注：上述数字表示相对敏感度，括号内数字不确切 生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁 生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件， 结构， ， 结构，pH，温度以及细胞的变化也影响对破碎的敏感度
3.3.1 破碎率的评价
破碎率的定义： 破碎率的定义：
N0 − N x(%) = ×100% N0
㈠ 珠 磨 法
微生物类型： 微生物类型： 酵母较细菌在珠磨机中更易破碎 ，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞 的十分之一， 的十分之一，在高速珠磨机中不易破 碎。
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法
延长研磨时间，增加珠体装量， 延长研磨时间，增加珠体装量，提高基 本速度等均可提高细胞破碎率， 本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率 能耗加大 同时: 加大。 ，使能耗加大。同时: 产生较多热能，增加冷却控温的难度； 1、产生较多热能，增加冷却控温的难度； 2、大分子目的产物失活增加 细胞碎片较小，碎片不易分离， 3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续 操作带来困难。 操作带来困难。 因此,破碎率控制在80 以下。 80％ 因此,破碎率控制在80％以下。
3.3.2 破碎方法
动力学方程： 动力学方程：遵循一级动力学方程
㈠ 珠 磨 法
dR = k ( Rm − R ) dt
... 3.1
R：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g） ： 时间内释放的蛋白质数量（ ） Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎 能释放的蛋白质最大数量， ％ k：破碎的比速率 ：
Rcq E=
p
... 3.4
R：每Kg成品酵母释放的蛋白质数量 ： 成品酵母释放的蛋白质数量 q：物料通过量 ： c：酵母的浓度 ： P：5L珠磨机中，用于破碎所消耗的功率 珠磨机中， ： 珠磨机中
图3.6 某一珠磨机下的效率在不同流量和搅拌速率
影响破碎效率的因素
细胞浓度： 细胞浓度： ㈠ 珠 磨 法 影响悬浮液的流变特性， 影响悬浮液的流变特性，从而影响 蛋白质的释放， 蛋白质的释放，一般由实验确定 一般控制在40％左右，细胞湿重/ 一般控制在40％左右，细胞湿重/体积 40
1 ln = kpα N 1− x
K:与温度， K:与温度，粘度等有关的速率常数 与温度 2.9（酿酒酵母）；2.21(大肠杆菌 ）；2.21(大肠杆菌) α：2.9（酿酒酵母）；2.21(大肠杆菌)
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法 影响细胞破碎的因素： 影响细胞破碎的因素： 温度 压力 循环操作次数 细胞浓度 阀座形式
3.3 细胞壁的破碎
表3.2 细胞对破碎的敏感度
细胞 动物细胞 革兰式阴性芽孢杆菌和球菌 革兰式阳性芽孢杆菌 酵母 革兰式阳性球菌 孢子 菌丝 声波 7 6 5 3.5 3.5 2 1 搅拌 7 5 （4） ） 3 （2） ） （1） ） 6 减压 7 6 5 4 3 2 （1） ） 冷冻压力 7 6 4 2.5 25 1 5
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法
动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素 动力学方程： 主要有压力、循环操作次数和温度。 主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率 与操作压力P和循环操作次数N X与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表 达为：（服从一级反应规律) ：（服从一级反应规律 达为：（服从一级反应规律)
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动， 原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球 和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨 ，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎 产热由夹套带走。 。产热由夹套带走。
珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体 珠磨机主体： 一般，卧式比立式珠磨破碎效率高： 一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为 立式机中向上流动的液体在某种程度上会 使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。 使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。 研磨珠：玻璃(密度为2.5g／ 研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化 2.5g 密度为6.0 g／ 微球(粒径约0.1 0.1～ 锆(密度为6.0 g／cm3)微球(粒径约0.1～ 10mm)，填充率为80％～85％。 10mm)，填充率为80％～85％。 80％～85
第三章
细胞破碎 与分离 3.1 概述 3.2 细胞壁的结构及组成 3.3 细胞壁的破碎 3.4 包涵体的分离与蛋白质的复性
3.1 概述
胞外产物 霉菌产生糖化酶等 胞内产物 基因重组产品等 分离纯化方法： 分离纯化方法： 使用分泌性宿主， ⑴ 使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外
⑵ 细胞破碎 物理法，化学法，机械法， 物理法，化学法，机械法，酶法
3.3.2 破碎方法
㈢ 超 声 波 法
图3.5 JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 JY92-
3.3.2 破碎方法
㈢ 超 声 波 法
作用机理： 作用机理：
在超声波作用下， 在超声波作用下，液体发生空化作用 (cavitaton)，空穴的形成、 (cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超 声波的细胞破碎效率与细胞种类、 声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。 声波的声频、声能有关。
k ∝u
... 3.3
该式有一定的适用范围， 该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增 加到一限定值后， 加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加
珠体积； 珠体积； －70%珠体积；∆－ 80%珠体积； 珠体积 珠体积 Ο－85%珠体积 珠体积
图3.5 搅拌速率与蛋白质释放的关系
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加， 转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加， 但产生的热量和消耗的功率也增加。 但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎 效率E被定义为： 效率E被定义为：
3.3.2 破碎方法
破碎方式 机械法 固体剪 切作用 液体剪 切作用 超声 破碎 非机械法 干燥 处理 溶胞 作用
高压 珠磨法 压榨 匀浆
酶溶法 化学法 物理法
图3.2 细胞破碎方法分类
3.3.2 破碎方法
图3.3 细胞破碎机理
3.3.2 破碎方法
㈠ 珠 磨 法
生产厂商: 生产厂商 瑞士WAB 瑞士 公司 德国西门子 机械公司 形式： 形式： 立式 效率高） 卧式（效率高） 图3.4 珠磨机简图
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 温度： 温度： 破碎率随温度的增加而增加 例如：操作温度由5℃增加到30℃ 例如：操作温度由5℃增加到30℃ 5℃增加到 破碎率约提高1.5 1.5倍 ，破碎率约提高1.5倍。 高温对破碎有利， 高温对破碎有利，但应考虑热变性 压力每增加10MPa 温度2℃ 10MPa， 2℃。 压力每增加10MPa，温度2℃。
电导率测定法：细胞破碎后， 电导率测定法：细胞破碎后，大量带电 荷的物质被释放到水相，使电导率上升 荷的物质被释放到水相， ，电导率随破碎率的增加呈线性增加。 电导率随破碎率的增加呈线性增加。 由于电导率与微生物的种类，处理 由于电导率与微生物的种类， 条件，细胞浓度，温度， 条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解 质含量有关，因此， 质含量有关，因此，正式测定应采用其 它方法测定标准曲线。 它方法测定标准曲线。
图3.7 微珠直径对破碎率的影响
影响破碎效率的因素
㈠ 珠 磨 法 温度： 温度： 热稳定性，目的产物不受破坏 热稳定性， 夹套冷却
影响破碎效率的因素
流量： 流量：
㈠ 珠 磨 法
Q↑ Q↑
k↓ V t= ↓ Q 释放量↓ 处理能力 ↓
破碎量↓ 但Q ↓
图3.8 流量对破碎速率常数的影响
影响破碎效率的因素
不能单纯追求高破碎率， 不能单纯追求高破碎率，随意增加操作 压力。 压力。
影响破碎效率的因素
㈡ 高 压 匀 浆 法 阀座形式： 阀座形式： 在相同的操作压力下，刃缘阀座比平 在相同的操作压力下， 边阀座破碎率高，但更易磨损。 边阀座破碎率高，但更易磨损。
3.3.2 破碎方法
㈡ 高 压 匀 浆 法