非结核分支杆菌病的诊断与处理

Taq I酶切的电泳结果（一）
M为DNA marker。第1列为脓肿分枝杆菌标准 株，其余为脓肿分枝杆菌临床株
Taq I酶切的电泳结果（二）
注：M为DNA marker。1、2列为经生化法鉴定为龟分枝杆菌 的临床株，3、4列为龟分枝杆菌标准株，第5列为脓肿分枝 杆菌标准株
PCR-DNA测序
PCR扩增细菌DNA的某个特异片段，直接测 定DNA碱基序列，分析分支杆菌种间序列 差异,可达到分支杆菌菌种鉴定的目的
(6)接受正规抗结核治疗的新发现肺结核病人 ， 疗程完成后仍反复排菌；
(7)已诊断为肺结核的病人应用各种抗结核药物 治疗无进步，痰菌仍呈阳性者；
(8)有免疫缺陷，并已除外肺结核的肺疾患者； (9)医源性或非医源性软组织损伤或外科术后伤
口长期不愈者。
具备以上条件之一，即为非结核分枝杆菌病可疑者。
非结核分枝杆菌肺病
非结核分枝杆菌病可疑者
重点是那些经正规抗结核治疗无效的结核病人。 (1)痰涂片荧光染色发现大分枝杆菌形体； (2)标本分枝杆菌培养阳性，但其菌落状态和生长情况
与人型结核菌有异； (3)初治病人首次分离出的分枝杆菌对抗结核药物耐药； (4)痰中发现抗酸杆菌而临床表现与肺结核不相符者； (5)经支气管卫生净化处理后痰分枝杆菌不能阴转者；
脓肿分枝杆菌（M.abscessus）病 必须包括对感染伤口的外科清创术或异物切除； 起始治疗可应用AMK合并CXT(12g/d)，以后可 根据临床好转情况和药物敏感试验结果，改口服 药；应考虑两药联合治疗，如CTM和FQ；严重 病例的疗程应至少3月，骨骼感染至少6月。
非结核分枝杆菌病的诊断与处理
上海市肺科医院 沙巍 肖和平 何国钧
〖背景〗
十九世纪八十年代 Robert Koch发现
发达国家 NTM病流行 日渐突出
HIV/AIDS的流行 使NTM疫情加剧
肺病
皮肤 骨关 节病
NTM病四种 主要表现
全 身 播
散
淋巴结炎
〖定义〗
1、非结核分枝杆菌（NTM)：指结核分枝杆菌 菌群和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌。
〖流行病学 〗
自然界普遍存在
尚未证实可以通过人传播
暴发流行 院内感染
流行具地理差异性
美国 MAC 和堪萨斯
英国堪萨斯
日本 MAC 和堪萨斯
苏格兰玛尔摩
中国快速生 长危害很大
〖菌种致病性〗
1、肺部病变 主菌种：鸟一胞内，堪萨斯，脓肿，蟾。 次菌种：猿，苏尔加，玛尔摩，偶然，龟
2、淋巴结炎症 主菌种：鸟一胞内，瘰疬。 次菌种：偶然，龟，脓肿，堪萨斯。
具有呼吸系统和（或）全身性症状，经放射影像学检查发现 有肺内病变，已排除其他疾病，在确保标本无外源性污染的 前提下 (1)痰NTM培养3次均为同一致病菌 (2)痰NTM培养2次均为同一致病菌，1次抗酸杆菌（AFB）涂
片阳性 (3)支气管灌洗液NTM培养1次阳性，阳性度2+以上 (4)支气管灌洗液NTM培养1次阳性，AFB涂片阳性度2+以上 (5)支气管肺组织活检物NTM培养阳性 (6)肺活检见与NTM改变相似的肉芽肿，痰或支气管灌洗液
NTM培养阳性
肺外非结核分枝杆菌病
(1)病变部位组织活检发现NTM 并显示分枝杆菌病的组织病理学特征；
(2)病变部位组织活检未发现NTM， 但显示分枝杆菌病的组织病理学特征， 在排除其他疾病的基础上，结合临床 表现，谨慎作出诊断。
NTM的鉴定分型
•染色特性、生长特征、微生物形态和生化 反应 ：培养鉴定，操作繁杂、费时
Runyon分类（1959年） 特点：根据细菌的生物学特征区分。 ☆与生长速度有关：
生长缓慢型和快速生长型 ☆突出色素形成与否及形成的条件：
光产色、暗产色和不产色 ☆以上述二点作为主要条件共分为I、
II、III、IV群。
Ⅰ群——光产色菌，如堪萨斯分枝杆菌、 海分枝杆菌
Runyon
Ⅱ群——暗产色菌，如蟾蜍分枝杆菌、瘰 疬分枝杆菌
分子生物学诊断的优点
快速：2-3天 准确 灵敏度高
分子生物学诊断的缺点
检测成本较高； 需要昂贵的仪器设备； 可能有假阳性； 操作复杂，要求高；
治疗现状
☆无特异高效的抗NTM药物 ☆抗结核药物仍在使用，但效果不佳 ☆NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁
通透屏障： ——是其广谱耐药的生理基础 ——是有效化疗的障碍
碳青霉烯类：亚胺培南(Imipenem,IPM)等 噁唑烷酮类（oxazolidinone）：利奈唑胺（Linezolid）
治疗进展3——老药新用
⊙磺胺类：磺胺甲恶唑（Sulfamethozole,SMZ） 复方磺胺甲恶唑（TMP/SMZ,SMZco）
⊙四环素类：强力霉素（doxycycline,DCC） 米诺环素（Minocycline,MOC）
•第二、第三或第四线药物 ：氯法齐明（CLO，100 mg，1 次/d），RFB(300～600 mg），1次/d；也可使用利福喷汀 RPT，环丙沙星(750 mg，2次/d)。
•在某些情况下应用AMK (7.5～10 mg.kg-1.d-1)
•应用异烟肼（INH）和吡嗪酰胺（PZA）无效
•免疫机制正常者应该接受至少18～24个月的治疗，AIDS患 者须终身服药。
•为类似肺结核的慢性肺部疾病。 •常规X线发现的肺部少量病灶的无症状者，
及已有 空洞的突然咯血患者。 •发生于基础疾病之上，特别是慢性阻塞性肺
疾病（COPD）、支气管扩张
非结核分枝杆菌淋巴结炎
•多见于儿童颈淋巴结炎 •耳部、腹股沟、腋下淋巴结也可受累 •多为单侧无痛性粗糙的淋巴结肿大，常有窦
道形成。
氟喹诺酮类（FQ）：司帕沙星(Sparfloxacin,SPFX)，莫 西沙星（Moxifloxacin)，乙胺沙星（Ct 934）
新大环内脂类：克拉霉素（Clarithromycin, CTM）， 阿齐霉素 (Azithromycin,ATM)
头霉素类：头孢西丁(Cefoxitin,CXT)，头孢美唑 (Cefmefazol,CMZ)
Ⅲ群——不产色菌，如鸟分枝杆菌复合
分
群（M.avium complex，MAC）、溃疡
类
分枝杆菌
Ⅳ群——快生长菌，如偶然分枝杆菌、龟 分枝杆菌、脓肿分枝杆菌
对于临床医生价值有限
➢微生物学家的分类方法
➢分枝杆菌微生物学方面的发展，包括 快速培养技术、DNA探针、高效液体色 谱分析方法
➢同一Runyon分类法下的分枝杆菌可以 导致完全不同的临床疾病
治疗进展1
· 疏水衍生物：利福布丁（Rifabutin,RFB） 等
· 破坏细胞壁：如乙胺丁醇(EMB) · 克服细胞壁通过障碍：如将抗结核药物加
入脂质体 · 多种机制不同的药物联用：如EMB、链霉
素（SM）、利福平（RFP）、环丙沙星 （CIP）等联用
治疗进展2——新药研制
利福类：RFB、利福喷丁(Rifapentin,RPE)、苯恶嗪利福 霉素1648(KRM~1648)
⊙氨基糖苷类：妥布霉素(Tobramycin,TOB) 阿米卡星（Amikacin,AMK）
治疗注意：药物敏感 试验，联合治疗，个 体化方案，疗程18~24 个月，至少12个月。
鸟分枝杆菌复合群病
•包含ATM(500 mg，1次/d)或CTM(500 mg，2次/d)在内的 两种或两种以上药物
•EMB(15 mg.kg-1.d-1)可作为次选药物。
56岁女性，反复咳嗽咳黄痰10年。2001年在我 院痰培养鉴定为偶然分枝杆菌
非结核分枝杆菌病的诊治指南
美国胸科协 会1997年
英国胸科协 会1999年
我国中华医学会结 核病学分会2000年
诊断
非结核分枝杆菌感染
同时具备以下两项条件者可诊断为非结核分 枝杆菌感染： (1)非结核分枝杆菌皮试阳性。 (2)缺乏组织、器官受到非结核分枝杆菌侵犯 的依据。
[快速生长分枝杆菌] 偶然分枝杆菌（M.fortuitum）病
尚无理想方案，外科清除感染部位。可用 AMK+CXT+ 丙 磺 舒 × 2 ~ 6 周 ， wenku.baidu.com 后 口 服 TMP/SMZ或DCC ×2~6个月。建议试用新大 环内酯类治疗。
龟分枝杆菌(M.chelonae)病： 外科清除可能有助于CTM对皮下脓肿的治疗。 应用CTM(500mg,口服,2/d) ×6个月。
其他 如鸟分枝杆菌复合群引起泌尿生殖系感染、 偶然分枝杆菌引起眼部感染等。
NTM肺病的影像学表现
•胸片:常见的是上叶尖后段浸润影、空洞或者多发结节 •HRCT上直径小于10mm的多发小结节或多发性支气管 扩张，还可见支气管小叶中央结节（即所谓的树芽征） •薄壁空洞多见，周围肺实质浸润较少 •较少发生支气管播散，一般为向周围肺组织直接播散 •很少出现胸腔积液
待检DNA DNA探针
反向杂交则预先将检测探 针固定在尼龙膜上,再与 变性的带有生物素标记的 PCR 扩增产物。探针的 固定在检测操作前就可准 备好, 从而使操作明显简 便、省时,适于大样本的 检测,
16S-23SrDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针 鉴定分枝杆菌菌种的研究
李国利,等. 中国防痨杂志, 2002.10,24(S1):12-14
堪萨斯分枝杆菌（M.Kansasii）病 •INH(300 mg，1 次 / d)、RFP(600mg，1 次 / d)、 EMB(15 mg/kg，1次/d) ，疗程18个月 •对不能耐受INH的患者，应用RFP和EMB治疗， 最初3个月加或不加SM治疗 •分离菌株对RFP耐药，可用 INH(900 mg，1次/d) 加 维 生 素 B6（ 吡 哆 醇 ， 5 0 0 mg/d）、EMB(25 mg.kg-1.d-1 ，和SM或AMK联用
非结核分枝杆菌皮肤病
•局部脓肿多由偶然、龟分枝杆菌引起 •海分枝杆菌可引起游泳池肉芽肿和类孢子丝 菌病； •溃疡分枝杆菌可引起Bairnsdale溃疡 •堪萨斯、苏尔加、嗜血分枝杆菌可引起皮肤 播散性和多中心结节病灶。
播散型非结核分枝杆菌病 表现为播散性骨疾病、肝病、心内膜炎、心 包炎及脑膜炎等。
DNA测序是检测DNA分子差异的最可靠方法
65000蛋白 编码基因
rPOB 基因
16S-23S rDNA
DNA探针
DNA 探针是能识别特异核苷酸 序列的带标记的一小段DNA分子
DNA杂交
DNA探针杂 交简易图
DNA探针杂 交简易图
正向杂交
反向杂交
DNA探针 待检DNA
正向杂交须先将PCR 产 物固定,再与检测探针进 行杂交,这样就要对每个 标本的扩增产物进行固 定,增加了操作步骤
原理：不同分枝杆菌种间的差异,其 本质是DNA水平上核苷酸序列存在差 异。这种差异可影响限制性内切酶 的切割位点,经限制性内切酶消化后, 形成的DNA 片段数目、大小不同。 凝胶电泳后分析指纹图谱的差异,可 对分枝杆菌菌种进行鉴定
先用分支杆菌属特异性 引物对标本DNA 进行扩 增,其扩增产物再经 RFLP 分析来鉴定菌种
2、非结核分枝杆菌感染（infection of nontuberculous mycobecterium）：感染 了NTM，但未发病。
3、非结核分枝杆菌病（disease of nontuberculous mycobecterium）：感染 了NTM，并引起相关组织、脏器的病变。
〖对NTM分类的认识〗
3、皮肤病变 主菌种：海，偶然，龟，脓肿，溃疡。 次菌种：鸟一胞内，堪萨斯，土地， 耻垢，嗜血。
4、播散性病变 主菌种：鸟一胞内，堪萨斯，龟，脓肿，嗜血。 次菌种：偶然，蟾蜍。
5、其它 海分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌还趋 向侵犯医源性创伤部位，在院内感染中占有一 席之地。
临床表现
非结核分枝杆菌肺病
用PCR-RFLP法鉴定脓肿分 枝杆菌和龟分枝杆菌
细菌
抽提基因组DNA
脓肿
Hae Ⅲ酶切
230bp
龟
230bp
230bp
PCR法扩增16s23srDNA部分序列
Taq I酶切
200bp 30bp
110bp 120bp
Hae Ⅲ酶切的电泳结果
M为DNA marker, 第1列为生化法初步鉴定为龟分枝杆菌的菌 株(即上图中的第7列菌株），再经全套生化法鉴定实为偶然 分枝杆菌，第2列为脓肿分枝杆菌标准株，其余为脓肿分枝杆 菌临床株
•BECTEC技术
•DNA探针、PCR限制酶分析和基因序列分 析： Hsp65基因、16S rRNA基因、DNAJ 基因，IS6110和rpoB基因
•高效液相色谱法和薄层层析
细菌菌种的快速鉴定
PCR
PCR-RFLP PCR-测序
DNA探针
PCR 聚合酶链反应 在体外合成基因序列
PCR-限制性内切酶片段多态性分析 （PCR-RFLP法）