荧光素_GOD_HRP荧光淬灭法测定植物果实组织中的葡萄糖含量

第22卷第1期海南大学学报自然科学版V ol.22N o.1 2004年3月NATURA L SCIENCE JOURNA L OF H AINAN UNIVERSIT Y M ar.2004 文章编号:1004-1729(2004)01-0057-04

荧光素-GOD-HRP荧光淬灭法测定

植物果实组织中的葡萄糖含量

占达东1,王周平2,吕家根3

(1.琼州大学化学系,海南五指山572200;2.西南师范大学化学系,重庆400715;

3.陕西师范大学化学系,西安710062)

摘　要:植物组织中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生的过氧化氢可在辣根过氧化物酶的

催化作用下使荧光素褪色并使荧光淬灭,基于这一现象,笔者建立了一种选择性测定植物果实

组织中葡萄糖含量的荧光分析方法,同时利用这种方法对苹果、鸭梨和酥梨组织液中的葡萄糖含

量进行了测定,并与分光光度法检测的结果及文献值进行了比较,结果表明:该方法具有安全、

方便、准确的优点,适合检测复杂样品尤其是植物中的葡萄糖含量.

关键词:G OD;HRP;植物果实组织;荧光素;荧光淬灭法;葡萄糖

中图分类号:Q554 文献标识码:A

葡萄糖在生物体内具有极其重要的生理意义,有关各种动植物体内的葡萄糖含量的测定已有大量的报道[1～8].由于检测的对象多为血液、组织液和细胞液,这些分析对象的组成往往十分复杂,尤其是植物组织液中的果糖和其他还原性物质常常对葡萄糖的分析产生严重的干扰,因此大多数的检测方法都是基于酶反应的高度选择性来消除各种共存物的干扰的.植物组织液中葡萄糖检测的经典方法是利用G OD催化氧化葡萄糖,使其生成过氧化氢,进而利用HRP催化过氧化氢氧化邻连茴香胺或高香草酸,使其生成有色产物,然后再以分光光度法或荧光法进行检测[8].该方法的主要缺点是邻连茴香胺和高香草酸不仅价格较高,而且都是致癌物质,这不仅会危害操作者的身体健康,同时也会对环境造成污染.本文所介绍的方法是在保留经典方法的高度选择性的同时,用廉价、安全的荧光素取代了连苯胺类物质,使过氧化氢在HRP的作用下氧化荧光素并使其褪色,因此以荧光法来检测剩余荧光素的含量便可间接地测定出葡萄糖的含量.由于荧光素在490nm处有很强的吸收,并在514nm处产生很强的荧光,因而对提高分析方法的灵敏度十分有利.为了使这一方法得到广泛的应用,笔者采用该方法分别测定了苹果、鸭梨和酥梨组织中的葡萄糖含量,并与分光光度法[9]的分析结果和文献报道的数值进行了比较,认为三者之间显示了较好的一致性.

1　实　验

1.1　试剂、材料及仪器　配制0、5、20、50、100、200、300、400mg・L-1的葡萄糖(分析纯)标准溶

收稿日期:2003-04-07

作者简介:占达东(1963-),男,海南琼山人,琼州大学化学系副教授.

液,4U ・m L -1的G OD (SIG MA )溶液(pH =5.2,0.01m ol ・L -1的NaAc -H Ac 缓冲溶液),25U ・m L -1的HRP (SIG MA )溶液(pH =5.2,0.01m ol ・L -1的NaAc -H Ac 缓冲溶液),0.25m ol ・L -1的氢氧化钠(分析纯)溶液,1.0×10-5m ol ・L -1的荧光素溶液.所有实验用水均为2次蒸馏水.

材料:红富士苹果(产地陕西)、鸭梨(产地河北)、酥梨(产地新疆),单个果质量为200～400g.仪器:F -4500荧光光度计(HIT ACHI )、T echcom -8500紫外可见分光光度计(H ong K ong ,天美)、BPC L -化学发光分析仪(中科院化学所),pHS -4C 酸度计(成都方舟)、恒温水浴.

1.2　实验方法 取葡萄糖标准溶液2m L 置于1

2.5m L 的比色管中,加入G OD 溶液0.1m L 后,在30℃的水浴中反应5min ,再依次加入1.5m L 1.0×10-5m ol ・L -1的荧光素溶液,0.1m L 的HRP 溶液(在30℃水浴中保温10min ),最后加入4m L 0.25m ol ・L -1的氢氧化钠溶液终止反应.反应后溶液的荧光强度至少可保持1d 内不变.在λem =514nm (λex =490nm )处,测定葡萄糖标准溶液的荧光强度.荧光光度计的工作状态:入射和出射狭缝宽度均为5nm ,光电倍增管的工作电压为700V.以分析所得的各标准溶液的荧光强度数值作葡萄糖浓度-荧光强度工作曲线和线性回归方程.

将待测果实沿脐到叶柄方向纵向切成几块,取其中一块用4层纱布包好,挤出果汁过滤,取滤液1m L ,稀释100倍后在沸水浴中加热10min ,再稀释10倍,制成待测液.按作工作曲线的方法测定待测液,并由待测溶液的荧光强度计算出果实组织的葡萄糖含量.

2　结果与讨论

2.1　荧光素浓度的影响　葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下,可被水中的溶解氧氧化并生成过氧化氢,在辣根过氧化物酶的催化下,荧光素被过氧化氢氧化成无荧光的小分子化合物,从而使得溶液的荧光淬灭,其淬灭程度与葡萄糖的量相关.荧光素的含量与待测葡萄糖含量之间也存在着匹配关系.果实中葡萄糖的含量通常在数千至数万毫克每升的范围内[9],对稀释1000倍的待测物,笔者选用1.0×10-5m ol ・L -1的荧光素,此时在0～400mg ・L -1质量浓度范围内的葡萄糖反应后,被检测到的荧光强度可成线性,对5mg ・L -1葡萄糖质量浓度的变化也有较灵敏的响应.

图1　pH 值对酶活性的影响　(化学发光法测定)

2.2　pH 对酶的稳定性和反应活性的影响　酶都是蛋

白质,具有许多极性,在不同的酸碱环境中,这些基团

的游离状态不同,所带电荷也不同,只有当酶蛋白处于

一定的游离状态时,酶才能与底物结合[10].通过实验,

笔者发现在pH =5.2,C =0.01m ol ・L -1的NaAc -H Ac

的缓冲溶液里,G OD 和HRP 都能保持良好的反应活

性.在溶液配制2个月后,用50mg ・L -1的葡萄糖溶液

检测G OD 和HRP 活性的变化,其分析信号与刚配制时比较未发现显著性差异.pH 对酶的催化活性影响的实验结果为:在pH =4.4～5.5的范围内,G OD 具有最佳的反应活性(见图1).而HRP 则在pH =7.0时显示出最高的催化活性[11].为同时兼顾这2种酶的催化活性,笔者采用了分段反应的方法,即先由G OD 催化溶解氧与葡萄糖的反应,此时溶液的pH 值在5.3～5.5范围内;然后加入pH 值为8.5的荧光素溶液和HRP 溶液,85海南大学学报自然科学版 2004年