抑菌实验—牛津杯法
牛津杯琼脂扩散法
牛津杯琼脂扩散法
牛津杯琼脂扩散法是一种用于初步判断化合物是否具有抗菌活性的实验方法。
这种方法利用了化合物在琼脂中的扩散能力，当化合物扩散到微生物生长的地方时，它会抑制微生物的生长，从而在琼脂上形成一个透明的圈。
这个透明圈的大小可以初步判断该化合物的抗菌活性。
牛津杯琼脂扩散法的操作步骤如下：
将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml（下层），待其凝固。
将融化的PDA培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。
以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10 mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。
在杯中加入待检样品（发酵液），牛津杯一般可以装240微升。
加满后培养基正面向上置37℃培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。
在培养过程中，一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。
305 牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2.2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅。
2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器（20~200μL，100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2.7试管：15×150 mm。
2.8 酒精灯。
2.9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯。
3. 病原菌、培养基及其他3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3.3 培养基：（1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4）乳酸菌：MRS肉汤。
（5）芽孢菌：营养肉汤。
3.4 其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间，则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
牛津杯法测定五倍子对大黄鱼病原弧菌的体外抑菌活力
子因富含鞣质( 单宁酸) , 对革兰氏阳性及阴性菌均 厂) , 手提式高压蒸汽灭菌锅( 上海博讯实业有 限公
有抑制和杀灭作用, 被应用于水 产动物细菌性疾病 的防治[ 3, 4] 。本实验运用乙醇蒸馏法、超声提取法两
司) , 垂直流超净工作台, 旋 转蒸发器 RE- 52AA ( 上 海亚荣生化仪 器厂) , 牛 津杯 ( 内 径 6. 0 mm ? 0. 1
菌株
抑菌圈
乙 醇蒸馏法 相对敏感度
抑菌 圈
超声处理法 相对敏感度
鳗弧菌
23. 87 ? 0. 85
+++
27. 72 ? 1. 03
+++
溶藻弧菌
25. 63 ? 1. 03
+++
27. 54 ? 0. 96
+++
哈氏弧菌
21. 35 ? 1. 15
+++
24. 37 ? 0. 87
+++
副溶血弧菌
2 结果
两组 培 养皿 直 接放 置 于 30 e 恒 温培 养 箱中 培 养 24 h; A 2、B2 两组培养皿置于 4 e 的冰箱中 24 h, 使药 液充 分 扩 散, 然 后 移 置 30 e 恒 温 培 养 箱 中 培 养 24 h[ 8] 。游标卡尺测量抑菌圈, 计算平均值, 进行对 比研究。抑 菌 直径 \20 m m 为极 敏感 / + + + 0; 15 mm [ 抑菌直径< 20 mm 为高敏/ + + 0; 10 mm [ 抑菌直径< 15 mm 为中敏/ + 0; 抑菌直径< 10 mm 为
5种酵母菌的体外抑菌实验
王旗 王祎丹 耿旭浩 河北农业大学5种酵母菌的体外抑菌实验Ｈ计， 梅特勒－托利多仪器 （上海） 有限公司。
指示平板法（１）指示平板的制备试验菌株酵母菌制备：将５种酵母菌接种于ＹＰＤ培养基中进行活化及传代培养，并利用分光亮度计测定吸亮度以测其菌液量，使其菌液量达到１０６ＣＦＵ／ｍ Ｌ。
（２）指示菌液的制备将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 分别接种于ＬＢ肉汤中进行活化及传代培养，并利用分光亮度计测定其吸光值使其菌液量达到１０６ＣＦＵ／ｍ Ｌ。
牛津杯法测定结果与分析酵母菌抑菌结果分析 注：＋＋＋，抑菌圈直径（ｄ）＞２０ｍｍ，表示极其敏感；＋＋，２０ｍｍ＞ｄ≥１５ｍｍ，表示高度敏感；＋，１５ｍｍ＞ｄ≥１０ｍｍ，表示中度敏感；－，ｄ＜１０ｍｍ，表示抗药。
从表结果可以看出，胶红酵母、葡萄有孢汉逊酵母对大肠杆菌具有抑菌能力，且葡萄有孢汉逊酵母对大肠杆菌抑菌能力最强，胶红酵母对大肠杆菌抑菌能力相对较弱，另外三种酵母无明显抑菌性能；胶红酵母、葡萄有孢汉逊酵母对金黄色葡萄球菌具有抑菌能力，且葡萄有孢汉逊酵母对金黄色葡萄球菌抑菌能力强于胶红酵母，克鲁斯假丝酵母Ｍ５－１３对金黄色葡萄球菌抑菌能力相对较弱，另外两种酵母无明显抑菌性能。
本实验所选取的５种酵母菌通过体外抑菌实验表明：隐球酵母ＡＰ－２０、毕赤克鲁维酵母ＢＰ－１８对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无明显抑制作用，而葡萄有孢汉逊酵母、胶红酵母、克鲁斯假丝酵母Ｍ５－１３对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。
验室或临床实践研究表明，酵母菌对肠道细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等引起的肠道感染、腹泻等疾病有保护预防性作用。
酵母菌代谢后产物对致病菌的拮抗、竞争排斥作用是产生上述功能的主要因素。
酵母菌拮抗作用产生的原因是多方面的： （１）酵母菌产酸，如乙酸、丙酸、乳酸等，酸对有害菌起生长抑制作用。
（２）酵母菌产抗生素或细菌素类物质，对有害菌有杀菌作用。
本试验从上述观点出发，用牛津杯法对５株酵母菌在体外的抑制菌能力及抑菌作用物质进行研究，为下一步动物实验打下基础。
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
管碟法（牛津杯法）的注意事项
管碟法（牛津杯法）的注意事项
(1)对于一般的抗生素测定来说,大多数情况下都需要把牛津杯加满,但作者在实际测定中发现,若加满牛津杯,培养24 h后牛津杯内仍有将近一半的残留溶液。
(2)管碟法测定Nisin 效价时,控制检测平板中菌悬液的浓度非常重要,过浓则抑菌作用不明显,过低则菌体生长稀疏,抑菌圈不明显或者不规则,难以准确测量
(3)过高的琼脂质量浓度(2 g/ dL 以上)冷却至50 ℃以下倒平板时,很快就会凝固,不便于制备菌层;而琼脂质量浓度太低时(低于1 g/ dL) ,培养基不容易凝固, ,产生的抑菌圈亦不太规则.
(4) 抗菌肽在牛津杯中的球形扩散过程中上层培养基越薄,越有利于抗菌肽的横向扩散,以及培养基越薄指示菌数相对更少一些故而抑菌圈大。
（5）加注的培养基如果温度太低，就容易结块不能均匀铺开，应为60-80o C.加注培养基底层之后，不应该立即给双碟加盖，以避免形成水蒸气。
（6）可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50o C水浴锅内保温。
试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂，继续保温5min使培养基温度回升，倒在底层培养基上，迅速转动双碟使培养基均匀铺开。
（7）放置小钢管时，注意管与管之间、管与双碟边缘不能太靠近。
（8）滴加时离钢管口距离不要太高，一旦滴管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，滴管口应避免太细。
滴加时若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去。
滴加后，液面应与小钢管口齐平，液面反光显黑色。
（8）双碟放入培养箱内，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放不能超过3个。
（10）测量抑菌圈直径时，不易取去小钢管或把双碟翻转过来测量抑菌圈直径。
牛津杯法抑菌试验的测定流程
牛津杯法抑菌试验的测定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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动物乳杆菌发酵液的体外抑菌试验
ｐ ｒ ｘｄ ｗｅ ｅ ｅｅ ｉｅ ｗｉｈ ｈ ｂ ｃｅｉｓａｉ ｅｆｃ ａ ａｎ ｔ ａ ｏ ｓ ｎ ｉａｏ ａ ｔｒｕ ｅｏ ｉｅ ｒ ｄ ｔｒ ｎ ｄ ｍ ｔ ｔ ｅ ａ ｔｒｏ ｔｔ ｃ ｆｅ ｔ ｇ ｉｓ ｖ ｒ ｕ ｉｄ ｃ ｔｒ ｂ ｃｅ ｍ ｂ Ｏｘｏ ｄ — ｉ ｉ ｙ ｆｒ —
菌 物与微生物技术重 Ｉ Ｉ
点实验 室提供 。
本试验 以分离 自猪肠道 的动物乳杆菌 Ｔ ２为试 １ 验材料 ，测定其发酵液中各种 化合物 的抑菌效果 ， 为 开发新 的食 品添 加剂及微生 物饲 料添加剂 提供 一定
的理 论 基 础 。
乳酸菌分布广泛 ， 是存在于人、 畜肠道 中的一种有 益微生物。许多乳酸菌都能产生有机 酸、 过氧 化氢以 及乳酸菌素等化合 物 ， 些物质在抑制多种病 原微 生 这 物和食物腐 败菌等 方面具有重要意义， 不仅 可抑制与 其亲缘关系相 近的乳酸菌 ， 而且对非乳酸菌 的革兰 氏 阳性细菌也具 有一定 的抑制作用。因此 ， 乳酸菌在 医
Ａｎｔｂａ ｔ ｒａｌ ｅ ｔ ｏ ｈ ｅ ｍ ａ ａ ｉ ｎ ｏ ｈ ｆ ｌ ｃ ｏ ｃｌｕ ｎｉ ａ ｉ ｉ ｖ ｔ ｏ ｉ ｃ ｅ ｉ ｔｓ ｆ ｔ ｅ ｆ ｒ ｔ ｔｏ ｂｒ ｔ ｏ ａ ｔ ｂａ ｉｌ ｓ ａ ｍ ｌｓ ｎ ｉｒ
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（ｏ ｅｅｏ ｉ ｃ ｎｅａｄＴｃ ｎｌ ｙＳｕ ｗ ｓ Ｕ ｉ ｒ ｔ ｆ ａ ｏａ ｔ ｓ ｉ ｕ ｎ Ｃ ｅ ｇ ｕ６ ０ ４ ， ｈｎ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｆ Ｓｉ ｃ ｎ ｅｈｏ ｇ，ｏｔ ｅｔ ｎｖ ｓｙ ｏ Ｎ ｔｎｌｉ ， ｃ ａ ｈ ｎ ｄ １０ １Ｃ ｉａ ｌ Ｌｅ ｅ ｏ ｈ ｅ ｉ ｒ ｉ ｉｅ Ｓ ｈ
ｃ ｐ ｔｓ．Ｔ ｅ ｅ ｕｔ ｈ ｗｅ ｔａ ｅ ｍｅ ｔｔｏ ｂ ｏｈ ｆ ｌｃｏ ａ ｉ ｕ ａ ｉ ｌｉ ｅ ｈ ｂｔｄ ｓｒ ｎ ｎ ｉ ｉ ｒ ｕ ｅ ｔ ｈ ｒｓ ｌ ｓ ｏ ｄ ｈ ｔ ｆｒ ｎａｉｎ ｒｔ ｏ ａ ｔｂ ｃｌ ｓ ｎｍａ ｓ ｘ ｉ ｉ ｔｏ ｇ ｉｈ ｂｔ ｙ ｌ ｅ ｏ ａ ｔｖｔ ｔｅ ｎｉ ａ ｔｒａ ｆｅ ｔ ｏ ｅ ｅ ｔｔ ｎ ｂ ｏｈ ａｔｒ ｅｉ ｎ ｔｎ ｃｄ ｃ ｕｒ ｄ ｅｔ ｉ ｈ ｎ ｅ ｎ ｃｉｉ ｙ； ｈ ａ ｔｂ ｃｅ ｌ ｅｆｃ ｆｒ ｎ ａｉ ｒｔ ｆｅ ｌｍｉ ａｉｇ ａ ｉ ｏ ｃ ｒｅ ｃ ｒａｎ ｃ ａ ｇ ａ ｄ ｉ ｆ ｍ ｏ
微生物实验五牛津杯琼脂孔洞法
实验五牛津杯（琼脂孔洞法）测定抗菌剂的抑菌效果一、目的：观察抗菌剂抗菌的作用效果，熟练掌握牛津杯法（琼脂孔洞法）体外测定抗菌物质的抗菌活性。
二、原理：抗菌物质从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗菌物质抗菌能力的强弱。
三、材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18 h得到的菌液。
2. 药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3. 器材：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5 cm 纸片、镊子、记号笔、尺子等。
四、实验步骤1.按照实验一（培养基的配制）的方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20 min后，放在60 ℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2. 将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（见表1）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1 mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15 mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。
（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37 ℃下培养24 h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
五、注意事项1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
六、实验结果表测定抗菌剂的抑菌效果思考题：如何判定防腐剂或抑菌物质的抑菌效果，说明其食品应用的指导意义。
附：1. 药敏试验判定标准表 抗菌药物的抑菌效果判定标准抑菌圈直径（mm ）敏感性 <9 耐药 9~11 低度敏感 12~17 中度敏感 >18高度敏感菌株 药物浓度（µg/mL ） 抑菌圈直径（mm ）抑菌圈平均数判定结果金黄色葡萄球菌氨苄青霉素101010 3030 30。
牛津杯法定量检测大蒜抑菌作用实验
牛津杯法定量检测大蒜抑菌作用实验一、实验目的1.了解大蒜对微生物中大肠杆菌的抑菌作用2.学习不同抑菌效价检测方法的原理和差异3.掌握牛津杯法的抑菌试验二、实验原理抑菌试验是指在体外测定样品的抑菌或杀菌能力。
在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业中，所用中药材提取物、天然活性物质（如多糖类、黄酮类和精油类等）和抗生素类等物质的抑菌性能是一个重要指标。
抑菌试验常用的方法有抑菌圈法、菌落计数法、最小抑菌浓度法和比浊法等。
牛津杯法属于抑菌圈法的一种，其原理是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到限制而形成透明圈——抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价。
它既可用于定性试验，也可用于定量分析，并且操作便捷、成本低廉、结果准确可靠，在多个领域被广泛使用。
大蒜是百合科葱属植物，具有医食同源性，既是调味品也是天然的药剂。
大蒜具有较高的营养价值，含有丰富的氨基酸、肽类、蛋白质、糖类、脂肪、无机盐、维生素以及蒜油。
同时它还具有抗菌抑菌、抗癌防癌、营养保健、降血压、抗击各种病毒侵袭、提高机体免疫力等功能。
大蒜被誉为“天然广谱抗生素”，对多种致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和致病性肠道细菌都有较强的抑制或杀灭作用，其抑菌的活性成分主要是含硫化合物等挥发性物质和大蒜素等。
本实验以大蒜作为待测样品、以大肠杆菌（Escherichia coli）作为指示菌，通过牛津杯法定量检测大蒜粗提物对大肠杆菌的抑制作用，让学生在掌握牛津杯法抑菌实验的同时，观察到大蒜粗提液的抗菌杀菌效果，从而增加对生活中食用大蒜对人体的抗感染和保健作用的了解。
三、实验方法1.试验菌种大肠杆菌（Escherichia coli）2.培养基与试剂1)LB液体培养基：胰蛋白胨10 g (1%)；酵母提取物5 g (0.5%)；氯化钠10g (1%)；蒸馏水1000 mL；pH值7.0~7.2。
2)LB半固体培养基（含1%琼脂）: 胰蛋白胨10 g (1%)；酵母提取物5 g(0.5%)；氯化钠10 g (1%)；琼脂10 g (1%)；蒸馏水1000 mL；pH值7.0~7.2。
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力
刘冬梅;李理;杨晓泉;梁世中
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2006(027)003
【摘要】益生菌的一个重要性质是对病原菌的抑菌活力,本文用琼脂扩散法的牛津杯法评价益生菌的抑菌活力.为得到准确和重复性好的结果,要从几个方面注意.在下述条件下,可以得到清晰可见的抑菌圈:牛津杯中的加液量为0.25mL,指示菌菌悬液的细菌浓度为105CFU/mL,在3～4℃冰箱预先扩散24h.
【总页数】2页(P110-111)
【作者】刘冬梅;李理;杨晓泉;梁世中
【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510640;华南理工大学植物蛋白质工程研发中心,广东,广州,510640;华南理工大学植物蛋白质工程研发中心,广东,广州,510640;华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.活力素纤维的抑菌机理及抑菌功能试验 [J], 王尤山;顾映影
2.牛津杯法测定五倍子对大黄鱼病原弧菌的体外抑菌活力 [J], 刘健;王海雁;赵淑江
3.活力素纤维的抑菌机理及抑菌功能试验 [J], 王尤山;顾映影
4.比较益生菌和中药组合对鸡源大肠杆菌抑菌效果分析 [J], 史雪坤;王慧青;苗天姿;高乐;张东远;汪恩强
5.牛津杯法测定抗菌肽对四种有害微生物的抑制效果 [J], 周芳;熊海涛;张江;柳永刚;宋凯
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实验二--食品防腐剂抑菌效果的测定(1)
牛津杯里的防腐剂向琼脂培养基扩散渗透，通过对
试验菌的抑杀作用而影响细菌的生长繁殖，在牛津 杯周围形成抑菌圈。依据抑菌圈的大小可以判断抑 菌能力的强弱。
三、实蛋白胨琼脂培养基
山梨酸钾溶液（0.20%、0.30%、0.40%、0.50%） （二）菌种 1、啤酒酵母 2、金黄色葡萄球菌
5、正置培养：
细菌 37℃ 6、结果判定： 根据牛津杯周围有无抑菌圈及其直径大小，来判 断该菌对山梨酸钾的敏感程度。用直尺测量抑菌 圈大小，并记录。 真菌 28℃
五、实验结果及分析
山梨酸钾浓度（%） 抑菌圈直径 0.20 0.30 0.40 0.50
啤酒酵母 金黄色
葡萄球菌
（mm×mm）
分析:
六、思考题
1、山梨酸钾抑菌的机理是什么？
2、山梨酸钾在食品中主要抑制哪些微生物？ 3、用管碟法测定时，为什么不用玻璃皿盖而
用陶瓦盖？
4、加牛津杯和药液：
标记药液浓度后，用无菌镊子将牛津杯等距离放 置在培养基上，用移液枪在每个牛津杯中加入不 同浓度的药液0.2mL。如下图：
1 2 0 3 4
1：0.20% 2：0.30% 3：0.40% 4：0.50% 0：空白
注意：（1）牛津杯内加入药液后不要再移动 （2）不能在陶瓦盖上做记号
（三）其他 1、无菌陶瓦盖培养皿2套 2、无菌生理盐水1瓶
3、无菌牛津杯10个
（四）仪器
1、超净工作台
2、1mL移液枪
四、实验步骤
1、熔化培养基
2、制平板
将熔化培养基倒入平皿内约25mL（培养皿底约
一半高度），待其凝固。
3、涂布平板接种
用移液枪吸取0.2mL菌液加到上述平板中，用无
乳酸菌代谢物体外抑菌机理探讨
试验研究
乳酸菌代谢物体外抑菌机理探讨
张丽芳
（江苏食品职业技术学院 食品工程系， 江苏 淮安 ２２３００３）
３７ ℃
７０ ℃
１００ ℃
１２１ ℃
２０
抑菌圈直径（ ｍｍ）
１０
０
Ｋ８８
致病性大肠杆菌
Ｋ９９
图 ４ 温度对 １－ ３ 菌株物质与抑菌活性的影响
－ ５－
饲料博览 ２００６ 年第 １２ 期
试验研究
表 １ １－ ３ 菌株所产抑菌物质热稳定性试验结果
处理温度 （ ℃）
处理时间 （ ｍｉｎ）
３７（ 对照）
７０
２５
１４ ｈ
１８ ｈ
２４ ｈ
３０ ｈ
２０
抑菌圈直径 （ ｍｍ）
１５
１０
５
０
Ｋ８８
致病性大肠杆菌
Ｋ９９
图 ２ １－ ３ 菌株不同培养时间发酵滤液
Á
对 Ｋ８８ 及 Ｋ９９ 抑菌效果
１０
活菌数（ ｌｇｃｆｕ·ｍＬ－１）
９
８
７
６ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ ２８ ３２ 培养时间（ ｈ）
图 ３ １－ ３ 菌株在 ＭＲＳ 液体培养基中活菌数变化曲线
Ｄｉｓｃｕｓｓｔｉｏｎ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｓｔａｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒ ｉａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＺＨＡＮＧ Ｌｉｆａｎｇ
（ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｕａｉ’ａｎ ２２３００３， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ ）
抑菌试验专业知识
注意事项
在超净工作台中或酒精灯旁操作 平板倒好，一定要平 牛津杯立直，才干确保杯内抑菌物质均匀
旳向四面扩散 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适
中，预防出现克制圈重叠，可在平皿中央 摆一种，外周等距离摆5－6个。
思索题
青霉素、头孢菌素类药物旳抗菌机制怎样？
药敏试验
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是 指对敏感性不能预测旳分离菌株进行试验， 测试抗菌药在体外对病原微生物有无克制 作用，以指导选择治疗药物和了解区域内 常见病原菌耐药性变迁，有利于经验性治 疗选药
牛津杯
“牛津杯”是放被测抗生素旳不锈钢小管， 小管内径为6mm，外径为8mm，高10mm旳 圆筒形管子，管子旳重量尽量相等。
三、试验操作
1. 倒平板：将已灭菌旳琼脂培养基加热到完 全融化，倒在培养皿内，每皿约20ml，凝 固。
2. 标识：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度
3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内旳菌 苔并稀释。
试验三 牛津杯法抑菌试验 （杯碟法）
扩散法又涉及纸片法、牛津杯法和打孔法。 因为扩散法操作简朴，成本低，已经被大多数 试验室和基层单位所采用
BETTER
稀释法涉及试管稀释法和微量稀释法，经 过测试细菌在含不同浓度药物培养基内旳 生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
扩散法
一、试验原理
将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌（指 示菌）开始生长繁殖；另一方面抗生素呈球面扩散， 形成递减旳梯度浓度，离杯越近，抗生素浓度越大， 离杯越远抗生素浓度越小。
在牛津杯周围抑菌浓度范围内旳细菌旳生长被克制， 形成透明旳抑菌圈。
抑菌圈旳大小反应测试菌对测定药物旳敏感程度 （药敏试验）或药物对指示细菌旳抑菌程度（抑菌 试验）。
牛津杯法比较青霉素
牛津杯法比较青霉素、链霉素对大肠杆菌的抑菌效果大小一、实验目的：二、实验原理：1、实验采用牛津杯法，通过测定比较抑菌圈大小来比较药物的抑菌作用大小。
抑菌圈越大，说明抑菌作用越大；反之，抑菌圈越小，说明抑菌作用越小。
2、在培养中，一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。
随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。
三、实验器材：溶液与试剂：青霉素、链霉素、无菌水、牛肉膏蛋白胨培养基（约200ml)、大肠杆菌菌悬液。
仪器及其他用品：电子天平、10ml离心管16支、无菌注射器、滤膜、牛津杯40个、培养皿13个、100μl、1ml、5ml移液枪及枪头、酒精灯、涂布棒、灭菌后的镊子、封口膜。
四、实验步骤：（在超净工作台中酒精灯旁操作）1、分别配制浓度为50μg/ml、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 的青霉素、链霉素药液；待用。
不同浓度梯度青霉素药液的配制：①分别称取5mg的青霉素，溶于10ml无菌水中，充分溶解后用滤膜过滤，得到浓度为500μg/ml的青霉素药液。
②取7支10ml的离心管，分别编号1~7号，1号装9ml无菌水，2~7装5ml无菌水。
③用移液枪取1ml的500μg/ml的青霉素药液于1号管中，得浓度为50μg/ml的药液，再依次从1管中取5ml于2中，然后从2中取5ml于3中；依次类似，最终配得浓度为50μg/ml、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 的药液。
照此步骤配制不同浓度的链霉素药液2、倒平板取13个个灭菌后的培养皿，分别倒入约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基。
冷却凝固待用。
3、接种用移液枪分别向13个培养皿中加入200μL的大肠杆菌菌悬液，涂布后待用。
4、加药液①取上述平板6个，在每个平板中放入3个灭菌后的牛津杯，呈正三角形排开。
抑菌试验测定方法
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纸片法、牛津杯法等，但原理都是一样的，纸片法做起来比较简单，不用特殊的材料，可能比较适合你：
1.把实验室用的普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121度，20分钟）。
2.将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取1ml该菌悬液至灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，倒入适量（约4毫米厚吧）已灭菌的培养基（温度约45度，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
3.将用于试验的农药配制成几个所需的浓度，用无菌镊子夹起一片滤纸放入药液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基的中心，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴。
4.按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。
5.在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小，计算抑菌率就OK了！
希望能对你有帮助，有什么问题可以短消息我：）
2。
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力一、本文概述本文旨在探讨使用牛津杯法测定益生菌抑菌活力的方法及其在实际应用中的意义。
牛津杯法作为一种经典的生物学实验方法，被广泛应用于评估益生菌等微生物的抑菌能力。
本文将详细介绍牛津杯法的实验原理、操作步骤、注意事项，以及实验结果的分析与解读。
本文还将讨论益生菌抑菌活力测定的重要性，以及益生菌在食品、医药等领域的应用前景。
通过本文的阅读，读者可以对牛津杯法有更为深入的了解，并掌握益生菌抑菌活力测定的基本方法，为相关研究和应用提供有力支持。
二、材料与方法1 益生菌菌株：选用具有抑菌活性的益生菌菌株，如乳酸菌、双歧杆菌等。
2 指示菌：选用常见的食品腐败菌或病原菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，用于评估益生菌的抑菌效果。
3 培养基：制备适合益生菌和指示菌生长的培养基，如MRS培养基、营养肉汤等。
1 益生菌菌株的培养：将益生菌菌株接种于适当的培养基中，在适宜的温度和湿度条件下培养至对数生长期。
2 指示菌的培养：将指示菌接种于营养肉汤或其他适宜的培养基中，培养至对数生长期。
（1）制备含指示菌的琼脂平板：将指示菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，使其形成一层均匀的菌膜。
（2）放置牛津杯：在琼脂平板上放置无菌的牛津杯，确保杯底与琼脂表面紧密接触。
（3）加入益生菌菌株：向每个牛津杯中分别加入等量的益生菌菌株悬液。
（4）培养与观察：将平板置于适宜的温度和湿度条件下培养一定时间，观察并记录抑菌圈的形成情况。
（1）测量抑菌圈直径：使用卡尺或直尺测量抑菌圈的直径，以毫米（mm）为单位。
（2）计算抑菌活力：根据抑菌圈直径的大小，计算益生菌菌株对指示菌的抑菌活力。
可以采用相对抑菌活力或绝对抑菌活力等指标进行评估。
（3）数据分析：对多组实验数据进行统计分析，比较不同益生菌菌株之间的抑菌活力差异，以及不同实验条件下的抑菌效果。
通过以上材料与方法，可以准确评估益生菌的抑菌活力，为益生菌的筛选、应用和开发提供科学依据。
抑菌试验操作规程
抑菌试验操作规程1．范围本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。
2．试验前准备设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。
3．操作步骤3.1 病原菌的制备3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。
3.2 检测样品的制备3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。
3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。
3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。
3.3 双层平板的制备3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，放置牛津杯时动作要轻；3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。
305-牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养,一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散,形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2。
2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅.2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器(20~200μL,100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2。
7试管：15×150 mm。
2。
8 酒精灯.2。
9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯.3。
病原菌、培养基及其他3。
1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌(乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3。
3 培养基:（1)大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
（2)金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
(3）沙门氏菌:营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4)乳酸菌：MRS肉汤。
（5)芽孢菌：营养肉汤.3。
4 其它：0.85％灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0。
30—0。
36之间, 则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备:（1)抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。