现代分子生物学-第四章
现代分子生物学课件-第四章
tRNA上所运载的氨基酸必须靠近 位于核糖体大亚基上的多肽合成位 点，而tRNA上的反密码子必须与小 亚基上的mRNA相配对，所以分子中 两个不同的功能基团是最大限度分 离的。
4. 2. 2 tRNA的功能
转录过程是信息从一种核酸分子 （DNA）转移到另一种结构上极为相 似的核酸分子（RNA）的过程，信息 转移靠的是碱基配对。
C
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
异亮氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
A
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Ile，I
）
）
R）
）
甲硫氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
G
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Met，
）
）
R）
M）
缬氨酸
丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸
U
（Val， （Ala，A （Asn，N （Gly，
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
A
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
G
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
U
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
A
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
V）
）
）
G）
分子生物学第四章
第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
第一节 RNA转录的概述
5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。
分子生物学 第四章 核酸的体外扩增
5′ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3′ tatccaacggctaggcattt
ataagcccgaaaggttcgtt 3′TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5′
变性（950C，30s）
5′ TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 3′
3′ ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 5′
ataagcccgaaaggttcgtt 退火（450C～550C，30s ～ 1min）
2、酶切分析
3、分子杂交 4、核酸序列分析
1 2 345
4：PCR扩增结果
六、PCR实验中常见问题对策
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是，不该出结果而出了结果 我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（一）假阴性：
应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性。最常见的原因：
延伸（720C，1 ～ 几分钟）
5′ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA 3′
ATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt
ataagcccgaaaggttcgttGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
分子生物学第四章生物信息的传递下
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
分子生物学 第四章
DNA聚合酶 填补碱基
DNA连接酶
核苷酸切除与UvrAB修复系统
错配修复中子代DNA的识别
针对复制错误，所以发 生与子代DNA分子
一个问题：如何区分子 代DNA分子?
大肠杆菌中子代新生分 子尚未甲基化，从而可 以区分
甲基化位点： 5’-GATC-3’ A甲基化 5’-CCA/TGG-3’ C甲基化
Holliday模型的缺陷与 Meselson-Radding修正模式
Holliday模型的缺 陷：切口是如何出 现在两条分子的同 一位置的？
单分子切口 切口链侵入未打开
的双螺旋，形成D环 被取代链断开，形 成另一个分子上的 切口 修正：在两分子切 口形成过程中引入 交换的D环
Holliday模型修正后无法解释 基因转换
物理和化学诱变导致突变
化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参 与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭
物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热
突变可能不影响基因组
存在很多不影响基因组功能的突变 沉默突变：
1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域， 对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因 组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同 义突变
重组的一般类型----同 源重组（一般性重组）
位点特异性重组（同源 区很短）
转座
同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ重组
可发生于两条 同源DNA的任 意位点
真核生物中， 发生于减数分 裂时期
重组是由于异源双链体DNA间发 生断裂与重连
两条双链DNA分子间的重组关 键是单链的交换
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
分子生物学-第四章蛋白质的翻译
教案首页课程名称分子生物学任课教师李市场第四章蛋白质翻译计划学时9教学目的和要求：掌握遗传密码的构成及特点。
遗传密码的破译；密码的简并性与变偶假说；密码子的使用频率；起始密码子与终止密码子；遗传密码的突变；重叠密码。
掌握原核生物和真核生物RNA的翻译过程。
核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌。
重点：密码的简并性与变偶假说；密码子的使用频率；起始密码子与终止密码子；重叠密码。
核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌难点：核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌。
思考题：1、以Prok.为例，说明蛋白质翻译终止的机制。
2、简要说明真核生物蛋白质的不同转运机制。
3、说明Prok.和Euk.体内蛋白质的越膜机制。
4、简要说明Prok.与Euk.的翻译起始过程的差别。
第四章蛋白质翻译（Protein Translation）概述：蛋白质翻译是基因表达的第二步，tRNA在翻译过程中起“译员”的作用，参与翻译的RNA 除tRNA外，还有rRNA 和mRNA；tRNA既是密码子的受体,也是氨基酸的受体，tRNA 接受AA要通过氨酰tRNA合成酶及其自身的paracodon的作用才能实现，tRNA通过其自身的anticodon而识别codon，密码子有自身的特性，三联体前两个重要通用性摇摆性，有一定的使用效率；多种翻译因子组成翻译起始复合物，完成翻译的起始、延伸和终止，并且保证其准确性。
分子生物学第四章TranscriptionElongation课件
• G/C rich hairpin are followed by a run of U residues in RNA
Function
• G/C rich → transcription delay
4.3 Transcription Elongation 4.3.1 Transcription delay(转录过程的延宕dang）
l 模板DNA中G/C的存在
delay
l promoter clearance
elongation complex
TFII E, H, ATP, Negative-superhelix needed
● Rho factor be needed for termination
Function RNApol + NusA-protein
RNApol pausing 60’’ more or less
K, Rho
termination
or read-through
Rho-factor (ρ)
l Hexamer 55kd neutral l Contest RNA 3’-end with βfactor
被激活的基因的表达方式，其RNA能顺利延伸
RNApol II stop at 3’-end of gene 并表现为DRBS (5,6-2氯-1-β-D呋喃核糖苯并咪唑) (5,6-dichloro-1-β-D ribofuranosyl benzimidazole)
l 非进行型复合体（Non-processive complex）
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
现代分子生物学 第四章课后作业
分子生物学第四章习题作业芮世杭222009317011027 09级一班1,遗传密码具有哪些特性？答：（1）遗传密码子的连续性，（2）.密码子有简并性；级一种以上密码子编码同意种氨基酸。
（3）.共有64个密码子，其中有1个起始密码子和3个终止密码子；（4）.密码子有通用性与特殊性，即不管是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的，但在各位生物中也有例外（5）密码子与反密码子存在相互作用。
2，有几种终止密码子？他们的序列别名是设么？答：终止密码子有三种终止密码子(UAG、UGA、UAA)，他们并不代表氨基酸，不能与tRNA 反密码子配对，但能被终止因子和释放因子识别，终止肽链合成。
其中终止密码子UAG叫注石（ochre）密码UGA叫琥珀（amber）密码UAA叫蛋白石（opal）密码3，简述摆动学说？答：1996年，由Crick根据立体化学原理提出，解释了反向密码子中某些稀有成的配对，以及许多氨基酸有两个以上密码子的问题。
假说中提出：在密码子与反密码子配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以摆动因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子一个tRNA能识别的密码子是由反密码子第一个碱基决定的。
反密码子第一位为A或C则只能识别一个密码子，若为G或者U则可识别两个密码子。
为I可识别三个密码子。
如果几个密码子同时编码一个氨基酸凡是第一，第二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的Trna.4，tRNA在组成及结构上有哪些特点？答：1、tRNA的三叶草型二级结构受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。
分子生物学 第四章 RNA的生物合成
第二节 转录的基本条件
一.反应体系
含DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ 。 其中原料为四种核苷三磷酸 NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U ； 合成过程: 连续，方向：5'→3' 合成部位：细胞核内。
二.转录反应的模板 转录反应不但需要DNA作为模板， 而且不同的RNA聚合酶对DNA两股链 以及不同的DNA段落都有一定的选择 性。
RNA聚合酶对利福平(rifampicin)和利福霉 素(rifamycin)表现敏感的原因
（二） RNA聚合酶对模板的选择
RNA聚合酶对模板的选择包含两层意思。 其一是不同的RNA聚合酶转录不同的基因， 合成不同的RNA。 其二是RNA聚合酶对DNA的两股链有选择性。
转录(transcription)的不对称性就是指 转录只以双链DNA中的一条链作为模板进行转 录，将遗传信息由DNA传递给RNA的现象。
他们的研究结果不仅破除了“酶一定是 蛋白质”的传统观点，而且也破除了“RNA 的功能只是控制蛋白质的合成”这一传统 观点。 因此他们于1989年共同获诺贝尔化学 奖。 此后RNA的重要功能不断有新的发现， 从而认识到——DNA是携带遗传信息分子， 蛋白质是执行生命功能的分子，RNA则既是 信息分子，又是功能分子。
二. RNA的结构与主要生理功能
RNA几乎总是线性单链的，极少有环状RNA分子。 但几乎每个RNA分子都有许多短的双螺旋部分，称为 发夹。 除了标准的GC和AU对之外，还有较弱的GU对可帮 助单链RNA形成二级结构。
一条正在延伸的RNA链的二级结构会影响这个RNA 分子的剩下部分的合成。
一个细胞中含有许多不同的RNA 分子，其长度为50个核苷酸到数万个核 苷酸不等。
现代分子生物学第四章作业【修订版】
现代分子生物学第四章作业（5-13题）7011128 牛旭毅，比较原核与真核的核糖体组成答：相同点：核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。
不同点：（1）原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。
真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。
（2）大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1……S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1……L33表示。
真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。
6，什么是SD序列其功能是什么答：定义：因澳大利亚学者夏因(Shine)和达尔加诺(Dalgarno)两人发现该序列的功能而得名。
信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S 核糖体RNA或真核18S rRNA 3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互补的富含嘌呤的3～7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。
功能：此序列富含A-G，恰与16SRNA3’端富含T-C的序列互补，因此mRNA与核蛋白体sRNA容易配对结合。
因此SD序列对mRNA的翻译起重要作用。
7，核糖体有哪些活性中心答：核糖体有多个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA- tRNA部位（A位）、结合或接受肽酰-tRNA的部位（P位）、肽基转移部位及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还应有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。
8，真核生物与原核生物在翻译起始过程中有什么区别答：原核生物的起始tRNA是fMet-tRNA(fMet上角标），30s小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNA(fMet上角标）结合，最后与50s大亚基结合。
真核生物的起始tRNA是 Met-tRNA(Met上角标），40s小亚基首先与Met-tRNA(Met 上角标）相结合，再与模板mRNA结合，最后与60s大亚基结合生成起始复合物。
分子生物学第4章重点及试题
一、名词解释：转录:是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。
转录单位 (transcription unit):从启动子到终止子的序列 (转录起始点)。
模板链（template strand）:又称反义链, 指与转录物互补的DNA链（极性方向3’→5’）。
编码链:又称有义链, 指不作模板的DNA单链（极性方向5’→3’）。
hnRNA：核内不均一RNA，是存在于真核细胞核中的不稳定，大小不均一的一组高分子RNA的总称。
转录的极性：转录的效率与转录单位的位置有关。
转录起始：RNA聚合酶与DNA转录启动子结合形成有功能的转录起始复合物的过程。
启动子（Promoters）：指DNA分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。
核心启动子：RNA聚合酶能够直接识别并结合的启动子。
RNA聚合酶：是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
C端结构域(CTD)：RNApolⅡ的大亚基中有 C 末端结构域。
CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Ser p－Pro－Thr p－Ser p－Pro－Ser p C端重复七肽。
沉默子（silencer）：沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子作用并最终抑制该基因的转录活性的真核基因中的一种特殊的序列。
增强子(enhancer)：是一类正调控元件，能够从转录起始位点的上游或下游数千个碱基处来激活转录。
绝缘子（insulater）：阻断增强子或沉默子的DNA序列。
上游：转录起点上游的序列，是调控区，与转录的方向相反。
下游：转录起点下游的区域，是编码区，与转录的方向一致。
转录起点：＋1位点，RNA聚合酶的转录起始位点，起始NTP多为ATP或GTP。
转录泡：在转录时RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）与DNA模板结合，会形成一个泡状结构，成为转录泡。
分子生物学第四章 基因与基因组的结构与功能
4.2 基因命名法
但是在研究不同生物的同一遗传机制时，往往会产生一些混淆，如 在研究酿酒酵母和粟米酵母的细胞周期有关基因的命名中。此外， 许多基因在不同实验中从相同组织被分离出好几次而具有不同命名： 重要的果蝇的发育基因torpedo便是其中一例——它在筛选不同表 型的过程中三次被鉴定并被命名三种不同名称。果蝇提供了关于遗 传命名的最为丰富的例子，特别是在发育生物学中这种趋势也扩展 至脊椎动物中。
总之：顺反子学说打破了“三位一体”的基 因概念，把基因具体化为DNA分子上特定的 一段顺序--- 顺反子，其内部又是可分的， 包含多个突变子和重组子。 近代基因的概念：基因是一段有功能的DNA序 列，是一个遗传功能单位，其内部存在有许 多的重组子和突变子。 突变子：指改变后可以产生突变型表型的最 小单位。 重组子：不能由重组分开的基本单位。
（三）DNA是遗传物质：1928年Griffith 首先发现了肺炎球菌的转化，证实DNA 是遗传物质而非蛋白质；Avery用生物 化学的方法证明转化因子是DNA而不是 其他物质。 （四）基因是有功能的DNA片段 20世纪40年代Beadle和Tatum提出一个 基因一个酶的假说，沟通了蛋白质合成 与基因功能的研究 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋 结构模型，明确了DNA的复制方式。
病毒(+)股RNA为2个拷贝,基本结构为:
５＇帽－R－U5－PB － －DLS－－gag－pol－env－ (onc－)－ C－PB＋－U3－R－poly(A)n 病毒颗粒中有两条相同的正股RNA+两条来自宿主细胞的 tRNA
A：编码区:所有逆转录病毒均含有3个基本结构基因
gag: pol: 病毒核心蛋白 肽链内切酶,一个逆转录酶,一个与前病毒整 合相关的酶 env: 包膜蛋白 B：非编码区: 与基因组复制和基因表达有关 A: B: C: R区: 两端的重复序列,与cDNA合成有关 引物结合区(primer binding site, PB) U区: U3 含强启动子,起始转录RNA. U5 与转录终止和加polyA有关 D: DLS--C区: DLS:两条病毒(+)RNA链结合位点 : 包装信号:RNA装入病毒颗粒 C: 调控区.
《现代分子生物学》第四章 1 DNA 复制
参与复制的DNA分子上 有两个区域，未复制的 区域由亲代DNA组成， 已复制的区域由两条子 代链组成。复制正在发 生的位点叫做复制叉 （replication fork）或 生长点（growing point）。
Origins can be mapped by autoradiography and electrophoresis Replicated DNA is seen as a replication eye flanked by nonreplicated DNA.
二、DNA聚合酶（包括DNA复制酶及参与复
制的附属反应或损伤DNA的修复合成）
1 大肠杆菌的DNA聚合酶 大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶：DNA聚合 酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅰ参与损伤DNA的修复，并在半保 留复制中起切除RNA引物的作用。 DNA聚合酶Ⅱ也参与修复。 DNA聚合酶Ⅲ是一个多亚基的蛋白质，是合成 DNA新链的主要复制酶。
Semi-conservative mechanism
15N
labeled DNA
15N
labeling experiment
1. 2. 3. 4.
15N
labeling: grow cells in ?? Collect DNA: grow cells in ?? Separation: method ?? Result interpretation
第四章
DNA 复制
DNA的复制（replication）是指以原来的DNA分 子为模板合成出相同的DNA分子的过程。
遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。 DNA复制在保持生物物种遗传的稳定性方面起 着重要的作用。
分子生物学实验第四章
实验产生的废弃物必须按照相关规定进行 分类、处理和处置，以保护环境和人类健 康。
常见问题解答
实验失败的原因
实验失败的原因可能有很多，如操作不当、试剂不纯、设备故障等，需要仔细分析并找出具体原 因。
数据异常的处理
如果发现实验数据异常，应首先检查实验操作是否规范，试剂和设备是否正常，如果问题仍然存 在，则需要重新进行实验。
利用抗原-抗体特异性结合的原理，检测目标蛋白在细胞培养上清液 或细胞裂解液中的含量。
荧光共振能量转移（FRET）
通过荧光标记的抗体与目标蛋白结合后产生的荧光信号变化，实时监 测目标蛋白的表达情况。
蛋白质组学分析
利用质谱技术对细胞或组织中的蛋白质进行鉴定和定量，从而全面了 解目标蛋白的表达情况及其与其他蛋白质的相互作用关系。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术，研究蛋 白质之间的相互作用。通过鉴定与特定蛋白质相 互作用的蛋白，揭示其在生物体内的功能和调控 网络。
转录因子活性分析
利用报告基因系统或荧光素酶报告基因系统，检 测转录因子的活性。通过观察转录因子对报告基 因的调控作用，分析其在基因表达调控中的作用 。
引物特异性
通过比对基因组数据库，确保 所设计的引物具有高度的特异 性，避免非目标产物的扩增。
PCR反应体系及条件优化
反应体系组成
包括DNA模板、引物、dNTPs、 DNA聚合酶和缓冲液等。
02
Mg2+浓度
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，其浓 度对PCR反应的特异性和产量有显著 影响。
01
循环次数
循环次数过多可能导致非特异性产物 的累积，过少则可能降低目标产物的 产量。
柱层析法
分子生物学 第4章 DNA损伤与修复
•F1 Mutaagenesis
OH
H
O
Br
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
:G
1. Base analog incorporation
AGCTBCCTA TCGAAGGAT
烯醇式
2. 1st round of replication
Br
H
O
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
AGCTBCCTA TCGAGGGAT
•Molecular Biology Course
第四章
DNA的损伤、修复和重组
教学要求
熟悉突变的种类和产生的因素 熟悉DNA损伤的原因、类型 理解DNA复制忠实性的机制 掌握DNA修复的机制 理解DNA重组的方式及原理
主要内容
第一节 DNA damage (损伤)
第二节 DNA repair(修复) 第三节 Gene mutation (突变） 第四节 Recombination (重组)
•DNA lessions
d.碱基修饰与链断裂
• 细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤， 能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基 修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤。
• 每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率 约为5万次。
•DNA damage
发生在需氧 细胞中。 电离辐射会加剧这种损伤。
•DNA lessions
2. DNA的自发性化学变化
• 生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化， 至少有以下类型：
–a.碱基的异构互变
–b.碱基的脱氨基作用
–c.脱嘌呤与脱嘧啶
–d.碱基修饰与链断裂
•DNA lessions
现代分子生物学第4章课后作业
1,遗传密码具有哪些特性？答：（1）遗传密码子的连续性（2）.密码子有简并性；级一种以上密码子编码同意种氨基酸。
（3）.共有64个密码子，其中有1个起始密码子和3个终止密码子；（4）.密码子有通用性与特殊性，即不管是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的，但在各位生物中也有例外（5）密码子与反密码子存在相互作用。
2有几种终止密码子？他们的序列别名是设么？答：终止密码子有三种终止密码子(UAG、UGA、UAA)，他们并不代表氨基酸，不能与tRNA反密码子配对，但能被终止因子和释放因子识别，终止肽链合成。
其中终止密码子UAG叫注石（ochre）密码UGA叫琥珀（amber）密码UAA叫蛋白石（opal）密码3，简述摆动学说？答：1996年，由Crick根据立体化学原理提出，解释了反向密码子中某些稀有成的配对，以及许多氨基酸有两个以上密码子的问题。
假说中提出：在密码子与反密码子配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以摆动因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子一个tRNA能识别的密码子是由反密码子第一个碱基决定的。
反密码子第一位为A或C则只能识别一个密码子，若为G或者U 则可识别两个密码子。
为I可识别三个密码子。
如果几个密码子同时编码一个氨基酸凡是第一，第二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的Trna.4，tRNA在组成及结构上有哪些特点？答：1、tRNA的三叶草型二级结构受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。
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3．反密码子第一位是I时，可识别3种密码子
反密码子 密码子 （ 3' ） X-Y-I （5'） （ 5' ） Y-XA/U/C（3'）
4. 2 tRNA • 为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接 合体，
•为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上 提供了运送载体。
又被称为第二遗传密码。
tRNA由较长的前 体加工而来
wobble hypothesis
1966年，Crick提出摆动假说 (wobble hypothesis)，解释 了反密码子中某些稀有成分 （如I）的配对，以及许多氨基 酸有2个以上密码子的问题。
• 前两对严格遵守碱基配对原则。 • 第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而 使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。
连续的(commaless)。
密码的简并性(degeneracy) 4种核苷酸可组成64个密码子: • • 61个是编码氨基酸的密码子； 3个即UAA、UGA和UAG是终止密码子
由一种以上密码子编码同一个氨基酸的
现象称为简并（degeneracy）
通用遗传密码及 相应的氨基酸 除色氨酸（UGG）只有一
成fMet-tRNAfMet才能参与蛋白质的生物合成。
2.同工tRNA
• 同工tRNA：代表相同氨基酸的 不同tRNA。 •在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一
于相同的氨酰-tRNA合成酶。
•同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该
氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上
的共同 性，能被AA-tRNA合成酶识别。
D臂是根据它含有 二氢尿嘧啶 (dihydrouracil） 命名的。D臂中存 在多至3个可变核 苷酸位点，17：1 及20：1、20：2。 最常见的D臂缺失 这3个核苷酸，而 最小的D臂中第17 位核苷酸也缺失 了。
D-arm and D-loop
Anticodon loop
反密码子臂是根据 位于套索中央的三 联反密码子命名的。 由5bp的臂和7个核 苷的环组成。在环 中有与密 码子互补的由3个核 苷组成的反密码子。
第四讲 生物信息的传递 （下）从mRNA到蛋白质
主要内容：
1、遗传密码-三联子
2、tRNA
3、核糖体 4、蛋白质合成的生物学机制
5、蛋白质运转机制
蛋白质的生物合成
• 核糖体是蛋白质合成的场所； • mRNA是蛋白质合成的模板； • 转移RNA (tRNA)是模板与氨基酸之
间的接合体。
• 蛋白质合成需要多种蛋白质、酶和 其他生物大分子的参与。 • 蛋白质合成是一个需能反应。
，所以分子中两个不同的功能基
团是最大限度分离的。
这个结构形式满足了蛋白质 合成过程中对tRNA的各种
要求而成为tRNA的通式。
tRNA的功能
• 为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接
合体，
• 为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体
上提供了运送载体。
tRNA的种类
1. 起始tRNA和延伸tRNA
2. 同工tRNA
4. 1. 2 遗传密码的性质
密码的连续性(commaless)
密码的简并性(degeneracy)
密码的普遍性(universality) 密码的特殊性(specificity) 密码子与反密码子的相互作用
密码的连续性(commaless) • 三个核苷酸编码一个氨基酸。 • 三联子密码是非重叠(non-overlapping)和
• 翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的 起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基 酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。
4. 1 遗传密码——三联子
贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递
到蛋白质上，mRNA与蛋白质之间的联系 是通过遗传密码的破译来实现的。 遗传密码： mRNA上每3个核苷酸翻译成多肽链上
poly(U) ---UUU--- polyphenylalanine
poly(C) ---CCC--- polyproline
poly(A) ---AAA--- polylysine
poly(G) --- did not work because of the complex secondary structure
的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一
个密码子（三联子密码）。
4. 1. 1 三联子密码及其破译
因为mRNA中只有4种核苷酸，蛋白质中有20
种氨基酸： • 以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可能的。 • 若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码（二 联子），能代表42=16种氨基酸。 • 若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种 密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。
随机共聚物为模板
Poly(UG)---poly(Cys-Val):
5’……UGU GUG UGU GUG UGU GUG ……
3’，无论读码从U开始还是从G开始，都只能有
UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。
特定序列的共聚物为模板
Nirenberg及Ochoa等又用各种特定序
列如只含A、C的共聚核苷酸作模板，任意
mRNA上的密码子与tRNA上 的反密码子配对示意图
a. 密码子与tRNA反密码 子臂上相应序列配对
b. 当反密码子第一位是I时， 密码子第三位可以是A、U或C。
tRNA上的反密码子与mRNA上密码子的配对与“摆动”分析
1．反密码子第一位是C或A时，只能识别一种 密码子。
反密码子 密码子 （ 3' ） X-Y-C （5'） （ 5' ） Y-X-G （3'） （ 3' ） X-Y-A （5'） （ 5' ） Y-X-U （3'）
Variable arm and T-arm
TψC臂是根据3个核
苷酸命名的，其中
ψ表示拟尿嘧啶； 由 5bp 臂 和 含 有 GTΨC的环组成。 可变臂(多余臂)是由
3到21个核苷组成，
可能会形成多达 7bp的臂。
tRNA三级结构(tertiary structure)
• tRNA的L-形三级结构: 研究酵母tRNAPhe 、tRNAfMet 和大肠杆菌tRNAfMet 、 tRNAArg等的三级结构，发现都呈L形折叠式。
• 长度: 60-95 nt (commonly 76) • 残基: 15 个invariant(恒定) 和 8个 semiinvariant(半恒定). invariant 和 semi-variant 核苷 的位置在二级结构和三级结构中起着重要的作用。
• 含有修饰碱基(Modified bases):
一 个 tRNA 究 竟 能识别多少个 密码子是由反 密码子的第一 位碱基的性质
2．反密码子第一位是U或G时，可分别识别两 种密码子。 反密码子 密码子 （ 3' ） X-Y-U （5'） （ 5' ） Y-XA/G（3'） （ 3' ） X-Y-G （5'） （ 5' ） Y-XC/U（3'）
决定的。
精氨酸 天门冬酰胺 天门冬氨酸 半胱氨酸
谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸
6 2 2 2
2 2 4 2 3
赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸
丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸
2 1 2 4
6 4 1 2 4
除了Arg以外，编码某一特定氨基酸的密码子个数 与该氨基酸在蛋白质中的出现频率相吻合
臂(arm or stem)和3个环(loop)。
tRNA三叶草形二级结构
D loop
T loop
Anticodon loop
Amino acid acceptor stem
受体臂（ acceptor arm） 由链两端序列配 对形成的杆状结 构和3’端未配对的 3～4个碱基所组 成。 其3’ 端的最后3 个碱基序列永远 是CCA，最后一 个碱基的3’或2’ 自 由羟基(—OH)可 以被氨酰化。
3. 校正tRNA
1. 起始tRNA和延伸tRNA
• 起始tRNA: 能特异性识别mRNA模板上起
始密码子的tRNA;
• 延伸tRNA:其他tRNA统称为延伸tRNA。
•真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸(Met)， •原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸(fMet)，
•原核生物中Met基酸都 有一个以上的密码子： • 9种氨基酸有2个密码子， • 1种氨基酸有3个密码子， • 5种氨基酸有4个密码子， • 3种氨基酸有6个密码子。
同义密码子(synonymous codon)： 对应于同一氨基酸的密码子
Synonym codons have the same meaning in the genetic code. Synonym tRNAs bear the
从遗传学的角度证实三联子密码的构想 是正确的 Crick等人发现T4噬菌体rII位点上两个基因的 正确表达与它能否侵染大肠杆菌有关，用吖啶 类试剂（诱导核苷酸插入或从DNA链上丢失） 处 理 使 T4 噬 菌 体 DNA 发 生 移 码 突 变 （frameshift mutation），噬菌体就丧失感染 能力。
tRNA三级结构(tertiary structure)
• tRNA三级结构主要由在二级结构中未 配对碱基间形成的9个氢键（三级氢键） 而引发的。
• 大部分恒定或半恒定核苷酸都参与三
级氢键的形成。
tRNA上所运载的氨基酸必须靠
近位于核糖体大亚基上的多肽合
成位点，而tRNA上的反密码子 必须与小亚基上的mRNA相配对
有时一个tRNA分子的 20% 的碱基是经过修饰的。已 发现有超过50 种不同类型的修饰碱基。
tRNA中所有4种碱基都能被修饰