增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较

论著

【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03

【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。

增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较

李卫华1,李德水2,刘洪琪2

(武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162)

摘　要:　【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和

bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性

瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和

bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白

合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。

关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子

【文章编号】　100825041(2005)022*******　【中图分类号】　R32912　【文献标识码】　A

The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation

L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China)

Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF

增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑

狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢

痕成纤维细胞的作用进行了研究。

1　材料与方法

111　材　料

11111　主要试剂:DM EM低糖型培养基由美国GIBCO公司生产,胎牛血清由中国医学科学院血液学研究所生产,EGF、PD GF、bF GF、粗制Ⅰ型胶原酶、离解蛋白DispaseⅡ、胰酶、N EM、Ⅶ型胶原酶、POP、POPOP、TritonX2100均由美国Sigma公司生产。β2氨基丙腈由上海生化公司生产,3H2脯氨酸(1mCi/ml)由北京原子能所生产。11112　实验器材:超净工作台由北京半导体设备一厂生产,CO2培养箱由日本Sanyo公司生产,倒置相差显微镜由日本Olympus公司生产,液闪计数仪由美国Bickman公司生产。

11113　标本的采集:本组10例标本取自住院患者手术时切除的增生性瘢痕(经病理组织学检查确诊),同时在植皮时获取患者剩余的正常皮肤。患者无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病,无心、肺、肝、肾等慢性疾病,3m内未使用过类固醇激素、青霉胺、抗肿瘤药物等,且未接受过放射线治疗。本组男7例,女3例,年龄6～42岁,瘢痕为烧伤后8m～3年,瘢痕凸出于皮肤表面,发红,痒、痛症状明显,因此可以确定瘢痕处于增生活跃期。

112　方　法

11211　成纤维细胞培养:我们采用消化法来进行成纤维细胞的原代培养。所得标本切除皮下脂肪组织,置于含青霉素和链霉素各100Iu/ml的DM EM 培养基中。2h后将组织标本浸于25%DispaseⅡ中,置于37℃条件下作用2h,完整撕下表皮层。真皮组织用PBS缓冲液反复冲洗后,剪切成1～2 mm的小块,加入30～50倍体积1mg/ml粗制Ⅰ型胶原酶,于37℃条件下继续消化2～4h。边消化边振荡,随时在显微镜下观察消化结果。当成纤维细胞大部分从包裹的胶原纤维中分离出来时,用100目不锈钢网过滤,去除大的组织块残渣,滤液离心,去除上清液,细胞计数后以(1～2)×105细胞/25ml培养瓶接种,以后每隔3d换1次培养液。待细胞融合后,用胰酶消化后传代。实验所用细胞为体外培养3～5代细胞。

11212　细胞生长动力学研究:实验分为正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组。以104细胞/孔接种细胞于96孔培养板上,每组24孔,对照组加入含014%FCS的DM EM培养基。实验组每组分别加入8ng/ml EGF、4ng/ml PD GF和4ng/ml bF GF的含014%FCS DM EM培养基,分别于细胞接种后第3、6、9、12d进行细胞记数。每次每组选取6孔细胞进行记数。最后绘制细胞生长曲线。

11213　胶原蛋白合成的测定:实验分为空白对照组、正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组,每组8孔。以105细胞/孔分别接种增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞于24孔培养板上,每孔加入1ml含8%FCS的DM EM培养液。分别于72、96h后去掉原培养液,加入014%FCS的DM EM培养基。120h后实验组每孔加入含有设定浓度的EGF、PD GF、bF GF和50μg/ml抗坏血酸钠的DM EM培养基。168h后加入3H标记的脯氨酸和β2氨基丙腈,使其最终浓度分别为5μCi/ml 和80μg/ml。192h后,根据Postlethwaite3的方法分别收集两份上清液,每份均为015ml。

一份上清液用于总蛋白含量的测定:在收集到的上清液中加入70μl012M Tris/013MCaCl2缓冲液(p H715),25μl FCS,30μl50mM N EM,75μl50%三氯乙酸/0175%鞣酸混合液,在4℃条件下静置30min,将析出的蛋白过滤到玻璃纤维滤膜上,25℃条件下隔夜烘干,置于闪烁液中进行液闪计数。另一份上清液中加入20μl纯化的细菌胶原酶(用Sephadex G2200凝胶柱过滤去除蛋白酶4),37℃孵育90min以去除胶原蛋白,剩余的蛋白进行液闪计数即为非胶原蛋白的量。最后用总蛋白的量减去非胶原蛋白的量,即为胶原蛋白的含量。最后结果以液闪计数cpm/105细胞表示。11214　统计学处理:每组标本均数间的比较用t 检验进行统计学处理。

2　结　果

211　细胞生长动力学测定结果

通过细胞生长动力学测定,发现增生性瘢痕成纤维细胞倍增时间约为6d,而正常皮肤成纤维细胞倍增时间为3d,细胞发生融合时前者的细胞数