《链霉菌的应用》

琼州学院生物科学与技术学院本科生学年论文设计论文题目《链霉菌的应用》作者刘琦指导教师徐小雄专业生物科学班级07生物科学（2）班完成日期：2010 年 6 月10 日琼州学院生物科学与技术学院本科生学年论文开题报告琼州学院生物科学与技术学院本科生学年论文设计综述题目《链霉菌的应用》摘要:链霉菌属革兰氏阳性放线菌，具有复杂的生活周期和次生代谢途径，并产生大量具有重要价值的天然代谢物。

本文首先概述了链霉菌的基本应用，其次论述了现阶段链霉菌的应用前景。

从基因方面论述了如何利用基因文库信息改造和调控链霉菌次生代谢途径。

为提高具有重要价值的天然代谢物的产量和获得新代谢物创造更有利的条件。

最后对组合生物合成在链霉菌中的应用做一综述。

关键词:链霉菌，基因文库，组成生物合成，次级代谢产物链霉菌的应用刘琦（琼州学院，生物科学与技术学院07生物科学2班，海南省五指山市，572200）链霉菌是有复杂生活周期的革兰阳性放线菌，该属的许多成员都能产生在医疗农业、食品等领域具有重要意义的天然次级代谢物[1]。

由于链霉菌属因在代谢过程，次代谢物为抗生素，所以链霉菌属常用于生产抗生素。

相较于其他菌种，链霉菌属繁殖较缓慢，但由于代谢过程的抗生素能抑制其他菌种的生长，所以时间一长，链霉菌属就会成为环境中的优势菌种。

目前所知的链霉菌属，有500余种；链霉菌属菌种与同属菌种，大都具有交换RNA的特性，所以新的链霉菌属菌种持继不断被发现。

微生物制药方面的工作都会或多或少的和链霉菌打点交道。

抗生素药物的一多半是放线菌产生的，产生抗生素的放线菌中有95％以上的是链霉菌。

后基因组时代的功能基因组研究使人类深入了解链霉菌家族，对链霉菌进行更合理高效的遗传操作，为提高具有重要价值的天然代谢物产量和获得新代谢物创造更为有利的条件。

本文就近年来链霉菌在各方面的应用，以及如何通过设计与构建基因文库，并结合基因工程等组合生物合成的手段，操纵天然产物的基因，最终达到优化链霉菌代谢合成途径, 提高天然代谢物产量和获得新代谢物的成果。

1、链霉菌产生的抗生素以及部分链霉菌的特殊应用1.1链霉菌产生的抗生素（链霉菌）链霉菌可产生多种类型的具有重要价值的次级代谢产物，如：抗生素、免疫调节剂等。

链霉菌被人们称为天然药物的合成工厂。

一次代谢物是维持生物合成或生长过程中所需的代谢物，至于对生命的维持不具明显的功能，只在某些生物上产生的代谢物，则是二次代谢物，如抗生素或色素等。

链霉菌可以产生多种二次代谢物，包括各种物质的分解酵素及抗生物质。

这些代谢产物除了可用在人体的医药以及当成家畜饲料的添加物外，在农作物生产方面，也可做为植物保护之用。

链霉菌是已知放线菌中最大的族群，可产生高达一千多种的抗生物质，许多重要的抗生素如放线菌素、链霉素、四环霉素、保米霉素、维利霉素、嘉赐霉素及康霉素等，都可由链霉菌生产。

一般而言，农用抗生素具有较低毒性及残留性质，可以抑制病原微生物的生长和繁殖，或者能改变病原菌的形态而达到保护作物的效果。

链霉菌产生的抗生素种类繁多且结构复杂，从结构上区分，大致可把农用抗生素分为下列六大类：氨基糖类抗生素：这类抗生素属于糖的衍生物，由糖或氨基酸与其它分子结合而成。

在植物体内具有移行性，可干扰病原细胞蛋白质的合成，如链霉素。

四环霉素类抗生素：这类抗生素是由四个乙酸及丙二酸缩合环化而形成，可以抑制病原菌核糖体蛋白，如四环霉素。

核酸类抗生素：这类抗生素含有核酸类似物的衍生物，作用于病原菌的去氧核糖核酸合成系统，抑制其前驱物或酵素的合成，如保米霉素。

大环内酯类抗生素：它是由 12 个以上的碳原子组成，且形成环状结构，通常可和细菌的 50 核糖体亚基结合，以阻断蛋白质的合成，如红霉素。

多烯类抗生素：由 25 ~ 37 个碳原子组成的大环内酯类抗生素，含有 3 ~ 7 个相邻的双键，可与病原真菌细胞膜上的类固醇结合，有破坏细胞膜的功能，如治霉菌素。

多肽类抗生素：这类抗生素是把氨基酸用不同的肽键结合，经常形成网状结构，可以抑制病原菌细胞壁的合成，如纯霉素。

由于多数链霉菌具有分泌抗生物质或细胞外酵素的能力，可以有效抑制植物病原菌。

此外，少部分还具有促进植物生长或诱导植物产生抗病性的效果，因此链霉菌在生物防治应用上极具潜力。

1.2泾阳链霉菌代谢产物的抑菌性能及发酵工艺优化泾阳链霉菌发酵液对枯草芽孢杆菌、乳链球菌、金黄色葡萄球菌及多种植物致病菌具有较强的抑制作用,其菌丝体的有机溶剂浸提液对细菌无显著抑菌作用,但相对于发酵液表现出对各种植物致病真菌有更强的抑制作用[2]。

1.3红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的应用红霉素因噬菌体污染会造成巨大的经济损失。

因此选育抗噬菌体菌株防治污染已成为抗生素工业生产的一个重要课题[3,4]。

从变稀的红霉素异常发酵液中分离出红霉素链霉菌噬菌体, 并利用该噬菌体采用不接触噬菌体的选育方法, 进行抗性菌株的选育, 获得了效价不低于现生产菌株, 并对历年来引起污染的4 株红霉素链霉菌噬菌体都具有抗性的 58#菌株。

该菌株在红霉素生产中使用后,基本杜绝了噬菌体污染, 保证了生产的正常进行。

1.4细黄链霉菌在玉米上的应用菌剂对地上部分的促生效果要好于对根的促生效果。

从实验结果可以发现使用 Streptomyces microflavus 005 菌液后能明显促进玉米苗期生长[5]。

2、基因文库的设计构建通过设计与构建基因文库，揭示基因组尤其是次级代谢基因簇信息，了解次级代谢途径的调节机理，为组成生物合成非天然的天然产物奠定了基础。

基因文库的设计构建具体地讲有两条设计思路：一种方法是先设计候选基因文库，对文库内各组成基因编码的生物大分子的理化特征进行定量评估[6]，然后对基因文库内的一些因素作出调整，通过半化学合成或生物合成的方法获得终产物，对其多样性进行分析比较，从而获得优化的设计方案。

另一种方法是通过计算模拟生物大分子识别位点配体的结构来完成设计。

3、组合生物合成在链霉菌中的应用利用获得的基因文库信息，通过组合生物合成手段，改造调控链霉菌的次级代谢途径，提高天然代谢物产量，获得新代谢物。

3.1 优化次级代谢途径，提高目的代谢物产量全基因组研究提供了较为清晰的代谢路径信息，使得操纵代谢途径以提高目标代谢物变得可行。

由于次生代谢物通常来自初级代谢中间物，通常采用增加这些代谢物前体来提高最终产物。

泰乐菌素合成途径中，由ty1F编码的大菌素转为泰乐菌素的步骤限制最终产物表达量的提高，克隆调控ty1F基因可提高泰乐菌素的发酵产量[7]。

基因组信息同样有助于研究那些同属内类似的但还没完全测序的菌株，ButlterM J等[7]根据S. coelicolor的基因组信息，在其相近种S. lividans中构建ACT和RED 的高产菌。

3.2 改造代谢途径，获得新的代谢产物3.2.1生物合成基因簇缺失、中断，得到新的抗生素及其衍生物陈芝等[8]对avermectin 生产菌阿维链霉菌的aveD 基因进行缺失改造，获得了aveD 缺失突变株。

缺失突变株的avermectin 的总产量与出发菌株的总产量基本相同, 但突变株中的B1组分产量略有提高，B2产量显著提高；余贞等[9]对不同链霉菌中的抗生素合成负调节基因nsdA进行研究发现，相似性高达77％～100％，并以不产生放线紫红素的变铅青链霉菌为出发菌株，中断nsdA基因，得到的突变菌株可合成放线紫红素。

3.2.2生物合成基因簇异源表达，获得新结构的化合物天蓝色链霉菌A (3) 2株中克隆的放线菌紫素合成基因(act)转移到其他的单色醌类抗生素生产菌中，如产双氢榴菌素的S.violaceoruber以产美达霉素的链霉菌AM7161株，基因转移的结果是形成新型杂合抗生素“双氢榴紫素”和“美达紫红素”[10]；此外，将炭霉素生产菌的异戊酞基转移酶基因carE，克隆到螺旋霉素的生产菌产二素链霉菌中，转化菌几乎100%地合成4- 异戊酞螺旋霉素；若将carE 基因克隆在变铅青链霉菌66株中，同时在重组菌培养液中加入螺旋霉素，则变铅青链霉菌也能通过生物转化作用合成相同的化合物。

3.2.3多种生物合成基因簇的基因重新组合，获得新的抗生素Khosla和Leadlay等基于模块结构的聚酮合酶基因的重新编程，使得人为设计抗生素的设想变为现实。

Chen等克隆了糖肽类万古霉素族抗生素chloroeremomvcin 的三脱氧糖基L-epivancosamine的合成基因，并成功的在大肠杆菌中表达，还在体外重建了从TDP-4- 酮基- 脱氧- 葡萄糖经过C-2 脱氧合作用、C-3 胺化和甲基化、C-4 酮基还原，C-5 表构异化等步骤得到了TDP-L-epivancosamine。

由于这是一个非常常见的糖基，它的基因克隆及表达为以后的组合生物合成新化合物提供了基础。

3.2.4 组合生物合成修饰改造酶，合成新的抗生素组合生物合成建立在对生物体内各种化合物的生物合成途径了解的基础上。

研究表明许多抗生素都有一套类似的合成途径，组成这些合成途径的酶称为PKS。

它分为两类：I 类PKS 也称为模块类，如红霉素、西罗莫司、利福霉素等；II类PKS也称为叠代或芳香类，因为它主要合成芳香族的化合物，如蕙环类及四环类化合物。

以I型PKS途径的14碳大环内脂聚酮化合物抗生素为例，其聚酮合酶基因编码的是数个多功能蛋白质，每一个蛋白质上带有对应于每一步碳链缩合及修饰的活性位点[11]。

由于聚酮合酶的初级序列上活性位点的数目和组成与抗生素主链结构存在一一对应的关系，这种对应关系有利于组成生物合成非天然的天然产物。

而II型PKS合成途径中，单位酶主要是确保那些不稳定的聚酮化合物中间体能正确组装折叠，因此，缺失其中环化酶、芳香化酶时，将导致大量结构各异的化合物产生[11]。

结语链霉菌的应用远远不止这些，现阶段除了要继续进行最基本的药性应用以外，我们还应当从其基因方面着想，后基因组时代的功能基因组研究使人类深入了解链霉菌家族的基因组信息和次级代谢途径。

运用组合生物合成手段，有针对性的改造基因，修饰酶结构，优化抗生素合成途径，对链霉菌进行更合理高效的遗传操作，为提高具有重要价值的天然代谢物产量和获得新代谢物创造更为有利的条件。

参考文献：[1]Bentley S D, Chater K F, Cerdeno-Tarrana,et plete genome sequence of themodel actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)[J]. Nature, 2002, 417:141[2]李成涛,孔阳,刘娜娜.泾阳链霉菌代谢产物抑菌性能研究及发酵工艺优化. 泾阳链霉菌抗菌能力研究[J]. 韶关学院学报(自然科学版), 2005,(03) .[3] 陈立,郭宝珠. 红霉素链霉菌抗噬菌体菌株选育和应用, 陈立, 郭宝珠. 中国医药工业杂志, 1997,(05).[4] 陈立,郭宝珠. 红霉素链霉菌抗噬菌体菌株选育和应用, 陈立, 郭宝珠. 中国医药工业杂志, 1997,(05).[5] 谭之磊,王来福,肖湘政,杨则媛. 细黄链霉菌005发酵条件优化及在玉米上的应用. 中国土壤与肥料,2008,(02).[6] Martin EJ.Blaney JM.Siani MA,et al.Measuring diversity design of combinatorial libraries for drug discovery.[J]. J med Chem,1995, 38:1431[7] Baltz R H. Genetic manipulation of antibiotic-producning Streptomyce[J]. Trends in Microbiology, 1998.6: 76[8] 陈芝，文莹，宋渊等.阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响[J] 微生物学报，2002，42：534[9] 余贞，王茜，邓子新，陶美凤.负调节基因nsdA在链霉菌中同源性以及激活沉默抗生素合成基因簇的研究[J]生物工程学报，2006，22：757[10] Hopwood D. A., et al., Production of“hybrid” antibioticsby genetic engineering[J].Nature, 1985, 314: 642[11] 郭锁莲,王相晶,向文胜. 组合生物合成在链霉菌次级代谢途径的应用,东北农业大学学报，2009，（07）.Application of StreptomycesAbstract：Streptomyces Gram-positive actinomycetes, have complex life cycle and secondary metabolism, and produce a lot of value with important natural metabolite. This article first provides an overview of the basic application Streptomyces, followed by the paper and the prospect of Streptomyces. From genetically discusses how you can utilize genomic information transformation and regulation of Streptomyces secondary metabolism. To enhance the value of an important natural metabolite of yield and obtain new metabolites in creating more favourable conditions. Finally on Combinatorial biosynthesis in Streptomyces do a review of the application.Key Words:Streptomyces;Gene library;composition biosynthesis;secondary metabolites琼州学院生物科学与技术学院本科生学年论文评议书。