过氧化氢酶——李坤
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PVA酶研究综述
李坤 导师：李江华
什么是PVA?
• • • •
Polyvinyl alcohol - 聚乙烯醇 高分子聚合物(1924) 主要用途：胶粘剂、纺织浆料、维纶 无毒、难降解物质
PVA的结构
• PVA的微观结构 • Microstructure of polyvinyl alcohol
• 细菌培养基（per l） 5.0g PVA, 1.0g
(NH4)2SO4, 1.0 g KH2PO4,8.0 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4· 2O, 0.1 gNaCl, 0.02 g 7H CaCl2· 2O, 0.01 g FeSO4, 0.5mg 2-H Na2MoO4· 2O, 0.5 mg MnSO4,0.4 mg Ca2H pantothenate, 0.2 mg inositol, 0.2 mg paminobenzoate,0.4 mg pyridoxine, 0.4 mg thiamine, 2 ug biotin and 0.5 ug vitamin B12. The pH was adjusted to 7.5.
P V A 的 生 物 降 解
Janthinobacterium sp. WSH04-01
*
*
*
假单胞菌中PVA的降解机理
两步反应：
（1）仲醇氧化酶（SAO）；
（2）二酮水解酶（BDH）或氧化型PVA 水解酶（OPH）。 特点： （1）产生过氧化氢； （2）完全降解； （3）降解与PVA性质无关。
1、不同氮源种类对PVA降解的影响
100 90 80
0.7
A
0.6 0.5
OD
B
PVA降解率 (%)
70 60 50 40 30 20 10 0 0 12 24 36 48
0.4 0.3 0.2 0.1 0
60
0
20
40
60
发酵时间 (h)
发酵时间 (h)
图2-1 不同氮源对PVA降解的影响 Fig. 2-1 Effect of nitrogen sources on PVA-degrading ▴硝酸铵 ○硝酸钠 △氯化铵 ▲酵母粉 □蛋白胨
富集方法
• 1、取样后，1g样品溶于9 ml of 0.8%
(w/w) NaCl solution中，30℃,200转摇床 10min。 • 2、1ml溶解液加入到含有150ml筛选培养基 的500ml曲颈瓶中， 30℃,200转摇床2天。 • 3、5ml富集液加入到含30ml培养基的 250ml锥形瓶中， 30℃,200转摇床3天。
获得序列
Purification of SAO
Acquiring Sequence
Engineering Strain
PVA酶产生菌的发酵条件探究
• 降解PVA混合体系的摇瓶发酵条件 • PVA降解酶粗酶液酶学性质研究 • PVA降解酶的退浆小试
降解PVA混合体系的摇瓶发酵条件研 究
• 氮源对发酵的影响 • 碳源对发酵的影响 • 环境条件对发酵的影响
溶解区
结晶区
PVA两步降 解反应酶
部分降解 反应酶
部分降解酶降解PVA的结晶区。
筛菌
• 霉菌培养基（per L） • 50g 葡萄糖, 3 g酵母粉, 1.6 g K2HPO4, 0.2
g KH2PO4, 0.05 g MgSO4,0.05g CaCl2,0.02 g FeSO47H2O，0.02 g NaCl and 0.5% PVA. 起始 pH接近6.0.
PVA上浆和退浆
溶胀 溶解 加 热 溶解
室 温
溶胀
上浆 织造 退浆
愿景：酶法替代传统PVA退浆
PVA 上 浆织物
纤维制造性能提高 高温水洗 PVA降解酶1 氧化剂 降低水耗、能耗
退浆织物
降低 织物损伤。
PVA降微生物2
无PVA 减少 出水 水体污染。
• 酶法替代传统PVA退浆的两个步骤：
① PVA退浆酶 ———— 晶体-溶胀态-PVA降解酶
数据来自张颖博士论文
PVA微生物降解两种机制比较
两步降解 部分降解反应 反应
PVA降解
PVA性质对降 解的影响 退浆效果
完全降解
不影响 不清楚
部分降解
受聚合度影响 有退浆效果
PVA微生物降解两种机制比较
中低分子量PVA 高分子量PVA
溶解区
两步降解 反应 PVA降解 PVA性质对降 解的影响 退浆效果 完全降解 不影响 不清楚 部分降解 反应 部分降解 受聚合度 影响 有退浆效 果
Pseudomonas O-3；P. vesicularis PD； Pseudomonas sp. VM15C；Sphingopyxis sp. PVA3； Pseudomonas vesicularis var. povalolyticus PH.
假单胞菌中PVA的降解机理
两步反应：
（1）PVA脱氢酶； （2）醛缩酶或二酮水解酶。 特点： （1）细胞形态变化；
工程菌构建技术 路线
上清液 Peptide Mass Fingerprinting 硫酸铵沉淀 N末端序列分析 离子交换层析 Blast in NCBI 凝胶过滤层析 ×N (亲和层析) SDS-PAGE PCR Amplification
Being Cloned into pPIC9K Acquiring positive plasmid Expression into GS115 （毕赤酵母） Screening on His- medium 表达鉴定 Selecting strains expressed in High level
（2）PVA完全降解；
（3）降解与PVA性质无关。
OPH
Sphingopyxis sp. 113P3； Pseudomonas sp. strain VM15C A. Faecalis KK314
什么是PVA降解酶
• 发现的聚乙烯醇降解酶主要包括: 聚乙烯醇
氧化酶( 仲醇氧化酶) 、聚乙烯醇脱氢酶、 双酮水解酶( 氧化型聚乙烯醇水解酶) 。
PVA降解酶
发酵单胞菌113P3
氧化型PVA水解酶 PVA脱氢酶
细胞色素C
二酮水解酶
PVA脱氢酶
已报道的PVA操纵子的结构
PVA降解酶
已报道的PVA降解酶基因序列
基因（登录号）
PVADH （AB008494） BDH （AB008494） OPH （AB190288） PVADH （AB190288） CytC （AB190288）
1号菌降解PVA过程分子量分布
Culture time/(h) 0 h in PVA1799 medium 72 h in PVA1799 medium 0 h in PVA124 medium 72 h in PVA124 medium Migration Time/(min) 16.113 16.283 16.667 16.700 Mn/（Da） 112981 98827 73762 73344
72
17.333
76511
Fra Baidu bibliotek
72
17.41
65863
Penicillium sp WSH02-21、 Streptomyces venezuelae GY1、 Janthinobacterium sp. WSH04-01 不能彻底降解培养基中的PVA。
数据来自张颖博士论文
混合体系中的部分降解菌
张颖从混合体系中分离出7株菌，其中1号和7号可以在平板上 形成透明圈。
方法
基因文库+酶活
菌株
Pseudomonas sp. strain VM15C Pseudomonas sp. strain VM15C Sphingopyxis sp. strain 113P3 Sphingopyxis sp. strain 113P3 Sphingopyxis sp. strain 113P3
• Nord FF 提出了PVA 是在一种脱氢酶的作用下在
细胞外将PVA 降解为水和CO2 的降解机制。
PVA的生物降解
• 1973年，SuzukiT 等又发现了能以PVA为唯一碳源的
Pseudomonas属细菌（假单胞菌） 。
• 了从20 世纪30 年代至今研究者已经发现的可以降解PVA
的微生物，主要包括细菌、真菌和放线菌，其中细菌类以 假单胞菌属最多，假单胞菌属也是研究者最早分离出的可 以降解PVA 的细菌。
《聚乙烯醇PVA生产消费现状及发展建议》
传统的PVA浆料的退浆
高温水洗 高能耗，高水耗。
PVA 上 浆织物
纤维制造性能提高
氧化剂
退浆织物
织物 损伤程度大。
含PVA 废水
PVA降 解慢，造成水 体污染。
• 欧盟的一些国家已经禁止使用纺织中使用PVA浆料。
愿景：酶法替代传统PVA退浆
PVA 上 浆织物
② 产PVA降解微生物 —— 溶解态-PVA降解酶
PVA微生物降解的另一种机制
利用平板透明圈筛选到3株菌
Penicillium sp WSH02-21、 Janthinobacterium sp. WSH04-01 、 Streptomyces venezuelae GY1
其中Penicillium和Janthinobacterium
PVA的生产和消费
• PVA生产和消费中心：进入21世纪，由日本转移到中国。 • 2005年，世界PVA产量 90万吨。中国40%，日本20%，美
国30%。
• 涂料和粘合剂是PVA主要的消费大户，占总消费量的
60%～70 %。
• 我国纺织浆料消费比例较高，年消耗13万吨，占中国PVA
消费的27 %。
16.113 17.087
Mn/(Da)
112981 75753
Janthinobacterium sp. WSH04-01 Culture time/(h) 0 36 Migration Time/(min) 16.113 17.073 Mn/(Da) 112981 85220
Streptomyces venezuelae GY1 Culture time/(h) 0 Migration Mn/(Da) Time/(min) 16.113 112981
纤维制造性能提高 高温水洗 PVA降解酶 氧化剂 降低水耗、能耗
退浆织物
降低 织物损伤。
无PVA 出水
减少 水体污染。
• 开发能够用于纺织退浆和PVA废水降解的
微生物酶来替代传统退浆工艺。
PVA的微生物降解
• 1936 年，研究者Nord FF发现了第一种可以降解
PVA 的微生物是Fusarium lini（镰刀菌 ），它是 一种植物致病真菌。
都有退浆效果。退浆率分别为60 %和80 %。 Streptomyces venezuelae GY1未测试。 菌株GY1在PVA平板上产生的透明圈
图片来自张颖博士论文
PVA的部分降解
Penicillium sp WSH02-21
Culture time/(h)
0 72
Migration Time/(min)
7号菌降解PVA过程分子量分布
Culture time/(h) 0 h in PVA1799 medium 72 h in PVA1799 medium 0 h in PVA124 medium 72 h in PVA124 medium Migration Time/(min) 16.113 16.431 16.667 16.767 Mn / (Da) 112981 84803 73762 66544
• 放线菌培养基 (per l): 1 g PVA，0.1g
NH4NO3, 1 g Yeast extract(Oxoid,England), 1.6g K2HPO4, 0.05 g MgSO4· 2O, 0.05 g 7H CaCl2, 0.02 g FeSO4· 2O, and 0.02g NaCl. 7H 起始pH为 7.2. 固体培养基添加2%琼脂。
参考文献
Shimao M. 1996
探针+亚基因文库
Shimao M. 2000
Nested PCR+天然酶 反向PCR PCR+天然酶+ AB190288中的序列 PCR+ AB190288中的序列
Kawai F. 2005
Kawai F. 2006
Kawai F. 2008
pvaA operon
反向PCR+ AB190288中 的序列
Sphingopyxis sp. strain 113P3
Kawai F. 2008
PVA降解酶应用于退浆
• 问题1. 已报道的PVA降解酶能够用于PVA退浆废水
的处理吗？
• 可以。 • 但成本很高。
• 问题2. 已报道的PVA降解酶能够用于PVA退浆吗？
• 没有相关报道。 • 从理论上推测：很难。
李坤 导师：李江华
什么是PVA?
• • • •
Polyvinyl alcohol - 聚乙烯醇 高分子聚合物(1924) 主要用途：胶粘剂、纺织浆料、维纶 无毒、难降解物质
PVA的结构
• PVA的微观结构 • Microstructure of polyvinyl alcohol
• 细菌培养基（per l） 5.0g PVA, 1.0g
(NH4)2SO4, 1.0 g KH2PO4,8.0 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4· 2O, 0.1 gNaCl, 0.02 g 7H CaCl2· 2O, 0.01 g FeSO4, 0.5mg 2-H Na2MoO4· 2O, 0.5 mg MnSO4,0.4 mg Ca2H pantothenate, 0.2 mg inositol, 0.2 mg paminobenzoate,0.4 mg pyridoxine, 0.4 mg thiamine, 2 ug biotin and 0.5 ug vitamin B12. The pH was adjusted to 7.5.
P V A 的 生 物 降 解
Janthinobacterium sp. WSH04-01
*
*
*
假单胞菌中PVA的降解机理
两步反应：
（1）仲醇氧化酶（SAO）；
（2）二酮水解酶（BDH）或氧化型PVA 水解酶（OPH）。 特点： （1）产生过氧化氢； （2）完全降解； （3）降解与PVA性质无关。
1、不同氮源种类对PVA降解的影响
100 90 80
0.7
A
0.6 0.5
OD
B
PVA降解率 (%)
70 60 50 40 30 20 10 0 0 12 24 36 48
0.4 0.3 0.2 0.1 0
60
0
20
40
60
发酵时间 (h)
发酵时间 (h)
图2-1 不同氮源对PVA降解的影响 Fig. 2-1 Effect of nitrogen sources on PVA-degrading ▴硝酸铵 ○硝酸钠 △氯化铵 ▲酵母粉 □蛋白胨
富集方法
• 1、取样后，1g样品溶于9 ml of 0.8%
(w/w) NaCl solution中，30℃,200转摇床 10min。 • 2、1ml溶解液加入到含有150ml筛选培养基 的500ml曲颈瓶中， 30℃,200转摇床2天。 • 3、5ml富集液加入到含30ml培养基的 250ml锥形瓶中， 30℃,200转摇床3天。
获得序列
Purification of SAO
Acquiring Sequence
Engineering Strain
PVA酶产生菌的发酵条件探究
• 降解PVA混合体系的摇瓶发酵条件 • PVA降解酶粗酶液酶学性质研究 • PVA降解酶的退浆小试
降解PVA混合体系的摇瓶发酵条件研 究
• 氮源对发酵的影响 • 碳源对发酵的影响 • 环境条件对发酵的影响
溶解区
结晶区
PVA两步降 解反应酶
部分降解 反应酶
部分降解酶降解PVA的结晶区。
筛菌
• 霉菌培养基（per L） • 50g 葡萄糖, 3 g酵母粉, 1.6 g K2HPO4, 0.2
g KH2PO4, 0.05 g MgSO4,0.05g CaCl2,0.02 g FeSO47H2O，0.02 g NaCl and 0.5% PVA. 起始 pH接近6.0.
PVA上浆和退浆
溶胀 溶解 加 热 溶解
室 温
溶胀
上浆 织造 退浆
愿景：酶法替代传统PVA退浆
PVA 上 浆织物
纤维制造性能提高 高温水洗 PVA降解酶1 氧化剂 降低水耗、能耗
退浆织物
降低 织物损伤。
PVA降微生物2
无PVA 减少 出水 水体污染。
• 酶法替代传统PVA退浆的两个步骤：
① PVA退浆酶 ———— 晶体-溶胀态-PVA降解酶
数据来自张颖博士论文
PVA微生物降解两种机制比较
两步降解 部分降解反应 反应
PVA降解
PVA性质对降 解的影响 退浆效果
完全降解
不影响 不清楚
部分降解
受聚合度影响 有退浆效果
PVA微生物降解两种机制比较
中低分子量PVA 高分子量PVA
溶解区
两步降解 反应 PVA降解 PVA性质对降 解的影响 退浆效果 完全降解 不影响 不清楚 部分降解 反应 部分降解 受聚合度 影响 有退浆效 果
Pseudomonas O-3；P. vesicularis PD； Pseudomonas sp. VM15C；Sphingopyxis sp. PVA3； Pseudomonas vesicularis var. povalolyticus PH.
假单胞菌中PVA的降解机理
两步反应：
（1）PVA脱氢酶； （2）醛缩酶或二酮水解酶。 特点： （1）细胞形态变化；
工程菌构建技术 路线
上清液 Peptide Mass Fingerprinting 硫酸铵沉淀 N末端序列分析 离子交换层析 Blast in NCBI 凝胶过滤层析 ×N (亲和层析) SDS-PAGE PCR Amplification
Being Cloned into pPIC9K Acquiring positive plasmid Expression into GS115 （毕赤酵母） Screening on His- medium 表达鉴定 Selecting strains expressed in High level
（2）PVA完全降解；
（3）降解与PVA性质无关。
OPH
Sphingopyxis sp. 113P3； Pseudomonas sp. strain VM15C A. Faecalis KK314
什么是PVA降解酶
• 发现的聚乙烯醇降解酶主要包括: 聚乙烯醇
氧化酶( 仲醇氧化酶) 、聚乙烯醇脱氢酶、 双酮水解酶( 氧化型聚乙烯醇水解酶) 。
PVA降解酶
发酵单胞菌113P3
氧化型PVA水解酶 PVA脱氢酶
细胞色素C
二酮水解酶
PVA脱氢酶
已报道的PVA操纵子的结构
PVA降解酶
已报道的PVA降解酶基因序列
基因（登录号）
PVADH （AB008494） BDH （AB008494） OPH （AB190288） PVADH （AB190288） CytC （AB190288）
1号菌降解PVA过程分子量分布
Culture time/(h) 0 h in PVA1799 medium 72 h in PVA1799 medium 0 h in PVA124 medium 72 h in PVA124 medium Migration Time/(min) 16.113 16.283 16.667 16.700 Mn/（Da） 112981 98827 73762 73344
72
17.333
76511
Fra Baidu bibliotek
72
17.41
65863
Penicillium sp WSH02-21、 Streptomyces venezuelae GY1、 Janthinobacterium sp. WSH04-01 不能彻底降解培养基中的PVA。
数据来自张颖博士论文
混合体系中的部分降解菌
张颖从混合体系中分离出7株菌，其中1号和7号可以在平板上 形成透明圈。
方法
基因文库+酶活
菌株
Pseudomonas sp. strain VM15C Pseudomonas sp. strain VM15C Sphingopyxis sp. strain 113P3 Sphingopyxis sp. strain 113P3 Sphingopyxis sp. strain 113P3
• Nord FF 提出了PVA 是在一种脱氢酶的作用下在
细胞外将PVA 降解为水和CO2 的降解机制。
PVA的生物降解
• 1973年，SuzukiT 等又发现了能以PVA为唯一碳源的
Pseudomonas属细菌（假单胞菌） 。
• 了从20 世纪30 年代至今研究者已经发现的可以降解PVA
的微生物，主要包括细菌、真菌和放线菌，其中细菌类以 假单胞菌属最多，假单胞菌属也是研究者最早分离出的可 以降解PVA 的细菌。
《聚乙烯醇PVA生产消费现状及发展建议》
传统的PVA浆料的退浆
高温水洗 高能耗，高水耗。
PVA 上 浆织物
纤维制造性能提高
氧化剂
退浆织物
织物 损伤程度大。
含PVA 废水
PVA降 解慢，造成水 体污染。
• 欧盟的一些国家已经禁止使用纺织中使用PVA浆料。
愿景：酶法替代传统PVA退浆
PVA 上 浆织物
② 产PVA降解微生物 —— 溶解态-PVA降解酶
PVA微生物降解的另一种机制
利用平板透明圈筛选到3株菌
Penicillium sp WSH02-21、 Janthinobacterium sp. WSH04-01 、 Streptomyces venezuelae GY1
其中Penicillium和Janthinobacterium
PVA的生产和消费
• PVA生产和消费中心：进入21世纪，由日本转移到中国。 • 2005年，世界PVA产量 90万吨。中国40%，日本20%，美
国30%。
• 涂料和粘合剂是PVA主要的消费大户，占总消费量的
60%～70 %。
• 我国纺织浆料消费比例较高，年消耗13万吨，占中国PVA
消费的27 %。
16.113 17.087
Mn/(Da)
112981 75753
Janthinobacterium sp. WSH04-01 Culture time/(h) 0 36 Migration Time/(min) 16.113 17.073 Mn/(Da) 112981 85220
Streptomyces venezuelae GY1 Culture time/(h) 0 Migration Mn/(Da) Time/(min) 16.113 112981
纤维制造性能提高 高温水洗 PVA降解酶 氧化剂 降低水耗、能耗
退浆织物
降低 织物损伤。
无PVA 出水
减少 水体污染。
• 开发能够用于纺织退浆和PVA废水降解的
微生物酶来替代传统退浆工艺。
PVA的微生物降解
• 1936 年，研究者Nord FF发现了第一种可以降解
PVA 的微生物是Fusarium lini（镰刀菌 ），它是 一种植物致病真菌。
都有退浆效果。退浆率分别为60 %和80 %。 Streptomyces venezuelae GY1未测试。 菌株GY1在PVA平板上产生的透明圈
图片来自张颖博士论文
PVA的部分降解
Penicillium sp WSH02-21
Culture time/(h)
0 72
Migration Time/(min)
7号菌降解PVA过程分子量分布
Culture time/(h) 0 h in PVA1799 medium 72 h in PVA1799 medium 0 h in PVA124 medium 72 h in PVA124 medium Migration Time/(min) 16.113 16.431 16.667 16.767 Mn / (Da) 112981 84803 73762 66544
• 放线菌培养基 (per l): 1 g PVA，0.1g
NH4NO3, 1 g Yeast extract(Oxoid,England), 1.6g K2HPO4, 0.05 g MgSO4· 2O, 0.05 g 7H CaCl2, 0.02 g FeSO4· 2O, and 0.02g NaCl. 7H 起始pH为 7.2. 固体培养基添加2%琼脂。
参考文献
Shimao M. 1996
探针+亚基因文库
Shimao M. 2000
Nested PCR+天然酶 反向PCR PCR+天然酶+ AB190288中的序列 PCR+ AB190288中的序列
Kawai F. 2005
Kawai F. 2006
Kawai F. 2008
pvaA operon
反向PCR+ AB190288中 的序列
Sphingopyxis sp. strain 113P3
Kawai F. 2008
PVA降解酶应用于退浆
• 问题1. 已报道的PVA降解酶能够用于PVA退浆废水
的处理吗？
• 可以。 • 但成本很高。
• 问题2. 已报道的PVA降解酶能够用于PVA退浆吗？
• 没有相关报道。 • 从理论上推测：很难。