第六章 人工染色体

2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段， 可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC 3 、酵母作为一种真核生物，为其它真核的 DNA提供了更合适的环境

四、 YAC克隆系统的缺点

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首 先 ， 在 YAC 载 体 的 插 入 片 段 会 出 现 缺 失 （ deletion ）和基因重排（ rearrangement ）的现 象。 其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的 插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。 嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。
正常酵母人工染色体含
有：
*四膜虫端粒（tel） 定位于染色体末端一段 序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶
降解，形成稳定的结构

酵母自主复制序列（ARS) 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进 行双向复制所必需的信号。

酵母着丝点 (CEN)
有丝分裂过程中纺锤丝 的结合位点， 使染色体 在分裂过程中能正确分 配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内 只有一个人工染色体的 作用。



lacZ 基 因 － 颜 色 鉴别重组子，外源 基因插入

Cre/loxP ： 来 自 P1 噬 菌 体 ， Cre 重 组 酶 基 因 和 loxP 序 列位于 P1 噬菌体基 因 组 内 ， loxP 是 Cre酶的识别序列

利用Cre/loxP直接构建外源基因的限制酶谱
人工合成的进行末端标记的含 有loxP序列的片段
拷贝的质粒载体。
2、F因子的特点

又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体 中。并能高频率的转移遗传标记。 F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一 般为每细胞 1～ 2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外 源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC 中外源基因的重组和嵌合度

• F因子具有携带 1Mb插入片段的潜能，这就使构建具有大 容量克隆能力的载体成为可能 • 将 F 因子经基因工程改良构成的 BAC 载体，可用于克隆 100 kb以上的DNA片段。

带有外源片段的 BAC 载体在细菌细胞（ 重组缺陷型， rec－） 中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子在细胞内


经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点 且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色 体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正 常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而 丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出ＨＡ Ｃ。
载体的种类和特征
受体细胞 质粒 λ 噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8kb 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列，λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1
变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1
基因的突变效应，形成正常的白色菌落。

由于酵母的染色体是线 状的，因此其在工作状 态也是线状的。但是， 为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的方式 存在，并增加了普通大 肠杆菌质粒载体的复制 元件和选择标记，以便 保存和增殖。
二、人类人工染色体

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1 、自上而下的策略：是以天然染色体的断 裂片段为基础，构建新的HAC 这些断裂片段主要通过以下方法得到 (ａ)低剂量辐射 (ｂ)端粒定位染色体截断技术 (ｃ)外源性ＤＮＡ片段定点插入后扩增 (ｄ)天然染色体有丝分裂过程中自发形成


将外源性端粒ＤＮＡ整合入哺乳动物染色体,可将该染色体截断,同时 在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体， 成功构建了一系列大小在 0.5 ～ 6Ｍｂ之间不等ＨＡＣ。最初，端粒 ＤＮＡ整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒ＤＮＡ 定点插入染色体中特定的位点。

BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合 及重组现象少 可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便 快捷 BAC 载体在克隆位点的两侧具有 T7 和 SP6 聚合


酶启动子，可以用于转录获得 RNA 探针或直接
用于插入片段的末端测序
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第三节 其他的人工染色体
一、P1人工染色体克隆系统-----PAC

所谓人工染色体 —— 是一类能在生物细胞中 独立 “ 稳定存在和遗传的人工重组 DNA 分子 ” 。
现正在研究的人工染色体

酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC，1000kb） 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC，300kb ） 哺乳类人工染色体（MAC）
第六章 人工染色体

生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生
化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与
成百至上万千碱基的DNA片段相关。

复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也
涉及到大片段DNA的研究。

因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的
重要发展方向之一。

随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的 日 益深入 ， 对可 插入大 片段 DNA 的克 隆 载 体——人工染色体的研究取得了迅速的发展
E. coli E. coli E. coli
粘粒载体
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome) YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的DNA大分子

克隆350kb
二、BAC载体的结构

1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯 霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131） 基础上构建了第一代BAC人工染色体。能
够克隆和保持大于100kb的DNA。
•新一代BAC载体为7.4kb
的环状质粒：
库更容易

BAC载体以环型超螺旋状态存在，BAC载体空载时大小 约7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个 氯霉素抗性基因。 外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC

载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入
大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源DNA后的重组质粒 通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的α – 互补筛选。
• F 因 子 的 parA，parB，
parC 基 因 以 保 证 低 拷 贝 的BAC质粒在大肠杆菌分
裂时均匀分配到子代细胞
• oriS 基因：来源于大肠
杆菌 F 因子（致育因子）
的严谨型控制的复制子

解旋酶基因－ repE ：一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋 酶 选择标志基因Cmr－氯霉素抗性 基因 cosN— 来源于 λphage 的 cos 位 点，可以用 λ末端酶切割 BAC使 之线性化 NotⅠ识别序列，位点十分稀少。 重组子通过 NotⅠ消化后，可以 得到完整的插入片段。

P1噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含 相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外
包装于P1壳内。P1进入宿主细胞后环化，扩增。

1994 年，有人将 P1 和 F 因子克隆结合产生 P1 人
工染色体克隆系统-----PAC。
• 基于 PAC 的 人类基因组文 库插入片段的 大小在 60kb～ 150kb 之间。
二、克隆策略

YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限
制性内切酶酶解后变成大片段 DNA，克隆进 根据标记性状筛选出重组的人工染色体
酵母载体 DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，
三、YAC克隆系统的特点

1 、 YAC 作为可提供大片段 DNA 的方法，简 化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基 因的过程（200～500kb，甚至1000kb）
（2）自下而上的策略 • 该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒ＤＮ Ａ、端粒ＤＮＡ以及复制起点装配在一起，从 而构建HAC。

研究者应用这种策略，在ＨＴ1080细胞中得到了第 一种ＨＡＣ。
他们将 >1Ｍｂ的人 17号染色体的 α卫星ＤＮＡ、人 端粒ＤＮＡ、人基因组ＤＮＡ随机片段用脂质体共 转染ＨＴ1080细胞。
pYAC4 ： 酵 母 第 四 条 染色体的着丝粒。


YAC 载体的选择标记
主要采用营养缺陷型基因
TRP 1：色氨酸生物合成基因缺陷型 URA 3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型 LEU 2：亮氨酸合成基因缺陷型 SUP 4：赭石突变抑制基因 作用方式： YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如 AB1380 ） 的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个 突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突
练习题

已知基因a的表达产物是一种酶A，已知这种酶 A具有几个保守位点，请考虑如何从基因组中 扩增基因a，并实现体外高效表达？需要使用 的质粒载体有哪些？酶切位点如何选择？
酶A
保守区1
保守区2
保守区3
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P1衍生人工染色体
总结
第一节 YAC——酵母人工染色体
一、YAC的基本序列元件
酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS） 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN） 酵母染色体的端粒顺序（TEL）
YAC
载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用 来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的 基因克隆。


YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响 了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿 酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相 近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。
第二节 细菌人工染色体（BAC）
一、BAC特点 1、是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高通量低
E. coli
E. coli E. coli
酵母细胞
哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
环状
环状 环状 线性染色体
35- 45kb
≈300 kb 100 - 2000 kb
100 - 1000 kb
〉 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
线性染色体 环状 环状
Cre酶识别loxP位点后形成的 线性化的BAC DNA
用相应的酶作不完全酶切，可 以获得长度不等的DNA片段 经PFGE电泳后进行放射自显 影，含有标记的loxP序列的片 段会有条带
三、BAC优点

BAC载体的容载能力一般为100～350kb 以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建BAC文库比YAC文