6.细菌内毒素检查
细菌内毒素检查SOP(动态浊度法)
细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）1．目的为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。
2．范围本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。
3．定义3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。
6．材料6.1.仪器设备细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱6.2.试剂及溶液6.2.1.鲎试剂6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。
6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。
6.3.使用的器具移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。
7．流程图无8．程序8.1.原理细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。
8.2.试验前准备8.2.1.采样管用硅胶塞塞口，经180℃干烤2小时，除内毒素备用。
细菌内毒素
细菌内毒素检查法一、细菌内毒素检查法的定义：●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。
二、背景介绍：●1、细菌内毒素●2、热原●3、鲎1、细菌内毒素●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质特性：●（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。
●（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。
●（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。
●（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。
2、热原2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质2.2细胞分裂素（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）内源性热原｛产生细胞分裂素的物质内毒素热原外源性热原｛非内毒素热原（病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）2.3热原和内毒素的关系：2.3.1热原是否就是内毒素？在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
3、鲎3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
又具有很高的药用价值。
3.2鲎试剂鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。
鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。
这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”。
鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的“鲎试剂”，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。
目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则1. 引言在当前社会背景下，食品安全问题备受关注，并且细菌内毒素作为食品中的一种重要污染物质也越来越受到重视。
为了确保食品的安全性，细菌内毒素检查成为一项非常重要的工作。
本文将从深度和广度的角度来评估细菌内毒素检查法的应用指导原则，并根据该主题进行讨论。
2. 细菌内毒素检查法的概述细菌内毒素是由细菌产生的一种有毒物质，它们可以污染食品并对人体健康造成潜在威胁。
细菌内毒素检查法的应用非常重要。
该方法一般包括样品准备、提取和分析等步骤。
通过采用适当的检测技术和方法，可以准确可靠地检测细菌内毒素的存在和含量。
3. 细菌内毒素检查法的准备工作在进行细菌内毒素检查之前，必须进行一些准备工作。
需要确定检测的细菌种类和内毒素类型，以便选择适当的检测方法。
样品的收集和保存也是一项关键工作，应该注意避免污染或降解。
还需要准备相关的实验室设备、试剂和标准品等。
4. 细菌内毒素检查的主要技术方法目前，细菌内毒素检查主要采用生物学方法和化学方法两种主要技术。
生物学方法包括毒素制备、生物学活性试验和鉴定等步骤，通常用于细菌内毒素的初步筛查。
而化学方法则依靠物质的化学性质或光学性质来进行分析和检测，常用的方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等。
5. 细菌内毒素检查的应用指导原则为了保证细菌内毒素检查的质量和准确性，应遵循以下应用指导原则：5.1 样品选择：应根据实际情况选择适当的样品进行检测，要注意样品的来源、存储和处理方式。
5.2 样品制备：样品必须按照规定的方法进行提取和制备，确保细菌内毒素的稳定性和提取效率。
5.3 适当的检测方法：应根据细菌种类和内毒素类型选择适当的检测方法，确保检测结果的准确性和可靠性。
5.4 外部质量控制：在进行细菌内毒素检查时，应严格遵循外部质量控制的要求，包括使用标准品进行校准和内毒素的稀释等。
5.5 结果解释和评估：在得到检测结果后，需要对结果进行解释和评估，确保对检测结果的理解和使用是正确的。
细菌内毒素检查法-动态浊度法
２ 试 验试 剂
２ ． １ 内毒 素标 准 品 细 菌 内毒 素 标 准 品 是 保 证 试 验
表示 ） 。 为人 用 按 规定 的 给 药途 径 不 发 生 任 何 临 床 每ｋ ｇ体 重 每 ｈ最 大 可 接 受 的 内毒 素 剂 的平行 与重复 性 的 重 要 参 照标 准物 质 ， 主要 分 为 工 作 不 良反 应 时 ，
中 图分 类 号 ： Ｒ ９ ２ ７ ． １ ２
细 菌 内毒素 检 查 法 也 称 鲎 试 验 法 ， 用 来 判 定 供 试 可满 足 于动 态浊度 法 检测需 要 。 品中 内毒素 含量 的 限量是 否符 合规 定 的分析 方 法 。 目
前， 国内 外 药 典 收 载 的 有 凝 胶 法 、 浊度 法 和显 色法。
成凝 固蛋 白， 在 产生 凝胶 过程 中发 生 浊 度变 化 ， 用 浊度 ３ ． １ 内毒 素 限 值 （ ， Ｊ ） 的确 定 有 两 种 方 法 可 以确 定 ） Ｊ ： ①依《 中国药典 》 规定 ： 《 中国药 典 》 仪检测 反 应混 合物 的浊 度 到达某 一 预先 设 定 的 吸光 度 内毒 素 限值 （ 所需要 的反 应 时 间 ， 或 是 检 测 浊 度 增 加 速 度 的方 法 。 此 方法 灵 敏度 高 ， 操作简单 ， 检 测 范 围广 （ ０ ． ０ ０ ６～３ ０ ０
Ｅ Ｕ ／ ｍ １ ） 。
２ ０ １ ０年版 中有 规 定 检 查 细 菌 内 毒 素 项 的 化 学 药 ４ ２ ４ 个， 生 物制 品 ３ ９个 品种 的 正 文 可 以 查 到 相 应 的 值 。
② 根据 人 的最 大 注射 剂 量 ： 计 算 公 式 为 Ｌ： Ｋ ／ Ｍ， Ｌ为 供 试 品 的 细 菌 内毒 素 限 值 （ 以 Ｅ Ｕ ／ ｍｌ 、 Ｅ Ｕ ／ ｍ ｇ 、 Ｅ Ｕ ／ Ｕ
细菌内毒素检查供试品干扰试验标准操作规程
范围：原辅料、成品职责：检验室对本规程的实施负责正文：1. 供试品细菌内毒素限值（L）的确定1.1 按供试品标准规定限值。
1.2 尚无标准规定的供试品内毒素限值，一般按以下公式确定。
L=K/M式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。
以EU/㎏/hr表示。
注射剂，K=5EU/㎏/hr，其中放射性药品注射剂K=2.5EU/㎏/hr，鞘内用药品，K=0.02EU/㎏/hr。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/kg/hr、mg/kg/hr、U/kg/hr 表示，中国人按人均体重60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计。
2. 供试品最大有效稀释倍数的计算：MVD=C·L/λL为供试品的细菌内毒素限值，λ为测试用鲎试剂的灵敏度标示值，C表示供试品的浓度，或供试品复溶所得溶液的浓度。
当L以EU/ml表示时C为1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/u表示时，C为mg/ml或u/ml。
如需计算供试品的测试浓度C，可设MVD为1。
3. 内毒素标准溶液的制备3.1取细菌内毒素国家标准品（NSE）或内毒素工作标准品（WSE）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
3.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水（BET）溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存4. 含供试品的内毒素溶液的制备4.1 根据供试品的限值（L）和使用鲎试剂的灵敏度（λ）计算供试品测试浓度（C）或MVD。
4.2 将供试品稀释，其稀释倍数不应MVD，并通过预试验确定正式试验供试品测试浓度。
细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检测标准细菌内毒素是一种由细菌产生的有毒物质，它可以对人体和动物的健康造成严重危害。
因此，对细菌内毒素的检测是非常重要的。
目前，国际上已经建立了一系列的细菌内毒素检测标准，以确保检测结果的准确性和可靠性。
首先，细菌内毒素检测标准包括了样品的采集和处理方法。
在采集样品时，需要注意避免污染和样品损坏，同时还要确保样品的代表性。
对于不同类型的样品，比如食品、药品、环境样品等，都有相应的采集和处理方法，以保证检测结果的准确性。
其次，细菌内毒素检测标准还包括了检测方法和技术的要求。
目前常用的检测方法包括生物学检测方法、化学检测方法和免疫学检测方法等。
这些方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
同时，检测设备和仪器的精密度和准确性也是检测标准中非常重要的一部分。
另外，细菌内毒素检测标准还规定了检测结果的解读和评定标准。
对于检测结果的阳性和阴性判定，以及毒素含量的测定，都有相应的标准和规定。
这些标准旨在保证检测结果的准确性和可比性，从而为食品安全、医药卫生等领域提供可靠的数据支持。
最后，细菌内毒素检测标准还包括了实验室质量控制和质量保证体系的要求。
实验室需要建立完善的质量管理体系，包括设备校准、人员培训、实验操作规范等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
总的来说，细菌内毒素检测标准是一套系统完整的标准体系，它涵盖了样品采集、检测方法、结果解读和质量保证等方方面面。
这些标准的建立和执行，对于保障食品安全、医药卫生等领域的公共健康具有重要意义。
希望各相关单位和人员能够严格执行这些标准，确保细菌内毒素检测工作的准确性和可靠性。
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理去检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用eu/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标注值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水熔化，在旋涡混合器上搅匀15分钟，然后做成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每吸收一步均应当在旋涡混合器上搅匀30秒钟。
抢分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复水溶性后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18两支，其中16管分别重新加入0.1ml相同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行搞4管；另外2管重新加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。
将试管中溶液轻轻搅匀后，半封闭管口，横向放进37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最小浓度2λ管均为阳性，最高浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效率。
按下式排序反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测量值(λc).λc=1g-1(∑x/4)式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度就是指系列递增的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
阻碍试验按表中1制取溶液a、b、c和d，采用的供试品溶液应属未检验出来内毒素且不少于最小有效率吸收倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度为丛藓科扭口藓核试验项下操作方式。
细菌内毒素检查法
移取注射液xml
MVD？
L· x/v=L×MVD ≥入,MVD≥入/L EU/ml
3.检查方法
（1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素）
②确定药品的细菌内毒素限值L； ③选择鲎试剂的灵敏度入；
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 该法优点：快速、灵敏。 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂
①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
c lg 1 ( X / 4)
复溶
内毒素检查用水
4支 4支
0.5λ 内毒素溶液 保温1h
结 果 有 效
2支
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒 素检查，并以λC 为该批鲎试剂灵敏度
呈阴性
18
式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是 指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
（4）取鲎试剂8支（0.1ml/支），两支作为样品检 查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产 品对照，2支标记为阴性对照，如下图所示
s1 s2 阳性对照 阳性产品对照 阴性对照
0.1ml水 0.1ml水 +0.1ml +0.1ml SMVD16 SMVD16
0.1ml水 +0.1ml E2入
3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
欧洲药典EP6.0细菌内毒素 (中文)
2.6.14 细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法(译自英国药典版，等同欧洲药典版。
见原文之附录BP2004EP5XIV A方法)2.6.14.本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法限度试验方法的制定者希望弄清楚，如在--.生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。
细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的(,,,试验)。
将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。
反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、和温度;反应要求有一定量pH 的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。
采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。
下面五种方法将在后面文章中介绍;方法:凝胶法;限度试验A方法:半定量凝胶法B方法:动力学浑浊法C方法:动力学发色肽方法D方法:发色肽终点法E当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法。
次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在A 专门文献中特别提到。
很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。
试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。
检测前的准备工作中，必须证实如下内容:1——所以的设备器皿不吸附内毒素。
——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的(定量法)。
——干扰素的排除;如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。
除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。
在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。
本试验包括如下试剂和标准溶液制备:标准细菌内毒素BRP;与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。
细菌内毒素控制及检测(通则1143)培训试题及答案
细菌内毒素控制及检测(通则1143)培训试题及答案细菌内毒素的控制和检测是非常重要的，以下是一些相关的培训试题和答案。
一、单选题（每题4分，共20分）1.细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准。
用于凝胶法时，其内毒素含量小于多少？答案：C。
0.015EU/ml。
2.常用的去除可能存在的外源性内毒素的耐热器皿是什么？答案：B。
干热灭菌法（250℃、30分钟以上）。
3.细菌内毒素的成分是什么？答案：B。
脂多糖。
4.当供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法是什么？答案：A。
将供试品的pH值调节至6.0~8.0.5.细菌内毒素检查法主要依靠什么来检测细菌内毒素？答案：D。
C因子。
二、多选题（每题4分，共20分）1.无菌药品附录中规定，必要时，物料的质量标准中应当包括哪些检查项目？答案：ABCD。
微生物限度、细菌内毒素、热原、培养基的外观。
2.细菌内毒素的活性单位的表达方式包括哪些？答案：AB。
EU、IU。
3.细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括哪些？答案：ABCD。
含有螯合剂、含有某些抗凝因子、含有葡聚糖类物质、含有干扰作用的小分子。
4.对于存在内毒素污染的物质或器具，可以选择哪些方法去除？答案：ABCD。
加热法、酸碱法、蒸馏法、吸附法。
5.热原污染的途径是什么？答案：ABCD。
注射用水、从原辅料中带入、从、用具、管道和装置等带入、制备过程中的污染。
三、判断题（每题4分，共20分）1.除菌过滤和湿热灭菌已经被证明不能有效地除去内毒素。
答案：√。
2.在使用凝胶法进行限度检测的情况下，当使用新批号的鲎试剂时，可不进行鲎试剂灵敏度复核试验。
答案：×。
1、细菌内毒素的成分是什么？细菌内毒素的成分是脂多糖。
2、当供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法是什么？将供试品的pH值调节至6.0~8.0.3、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化，来检测细菌内毒素的什么？细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化凝固酶原，来检测细菌内毒素。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法是一种常用的检测细菌内毒素含量的方法，以下是其应用指导原则：1. 临床应用：细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2. 检测细菌内毒素：细菌内毒素检查法可以检测细菌体内产生的内毒素，包括脂多糖、肽、毒菌素等，可以提供关于感染病原体的重要信息。
3. 适用菌种：该检查法主要适用于产生内毒素的细菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。
不同菌种产生的内毒素种类和水平可能有所不同，需要根据具体情况选择合适的检测方法。
4. 适用样本：内毒素检查法适用于各种临床样本，如血液、尿液、体液等。
不同样本中的内毒素含量可能有差异，需要根据具体情况选择合适的样本。
5. 检测方法选择：目前常用的细菌内毒素检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、质谱法（Mass Spectrometry）和生物活性检测法等，选择合适的检测方法需要考虑其敏感性、特异性、操作简便性和成本等方面的因素。
6. 结果解读：细菌内毒素检查结果应综合临床表现和其他检查结果进行解读，单一的内毒素检测结果并不能确定感染的严重程度和预后情况。
在临床应用中，需要综合患者的临床症状、实验室检查和影像学等多方面信息进行综合评估。
7. 质量控制：在使用细菌内毒素检查法时，需要进行质量控制，确保检测结果的准确性和可靠性。
这包括实验室操作规范、标准品的选择和存储、仪器的检验和维护等方面。
总之，细菌内毒素检查法在临床应用中有着重要的意义，可以提供有关感染病原体的重要信息，但需要根据临床情况综合判断和解读结果。
质量控制也是使用该检查法时需要注意的重要方面。
细菌内毒素检测方法介绍
样品内毒素检查
1、供试品最大有效稀释倍数的计算： C·L
MVD＝ λ
λ ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。 L：供试品细菌内毒素限值。 C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。
当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml；
当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的 单位为mg/ml或者u/ml。
实验材料及用具
1、仪器 2、器具
名称 天平 电热干燥箱 恒温水浴箱 水银或酒精温度计 漩涡混合器 计时器
器具分类
要求 感量0.1mg以下
～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃
/ 60min±1min
器具名称
反应试管
玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
内毒素限值L：参考兽药典“每1000庆大霉素单位含 内毒素的量应小于0.5EU”，即 L＝0.5EU/1000U=0.0005EU/U
鲎试剂标示灵敏度λ：0.125EU/U
供试品最大稀释倍数
C·L 4000U/ml×0.0005EU/U
MVD＝
＝
＝160（倍）
λ
0.125EU/U
供试品溶液制备：
供试品 0.4ml 4000U/ml 1.0ml 1000U/ml 2.0ml 500U/ml 2.0ml 250U/ml
的内毒素标准溶液各 0.1ml,每一浓度做 4 个平行管，另 2 支加入 BET 水作为阴性对照。 应
反应条件：37±1℃保温 60±2min。
平 行 各标准液浓度（EU/ml）反应结果 阴性 反应终点浓度 C X
药物分析化学试题与答案
药物分析化学试题一、简答题1、什么是分光光度法？2、什么是无菌检查法？3、什么是药材炮制？4、pH复合电极在使用中应注意哪些问题？5、试述pH计上温度补偿钮及定位器的作用各是什么？6、试述可见异物检查时，各类供试品的光照度各是多少？7、何为异常毒性检查法？8、何为热原检查法？9、何为细菌内毒素检查法？1、答：分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度,对该物质进行定性和定量分析的方法。
2、答：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
3、答：药材炮制系指将药材净制、切制、炮炙处理，制成一定规格的饮片，以适应医疗要求及调配制剂的需要，保证用药安全和有效。
4、答：①电极如较长一段时间内不用，应将其漂洗干净，吸干残留的纯化水，放入所附的装有浸泡液的浸泡瓶内存放。
②电极前端的敏感玻璃球泡不能与硬物接触，任何磨损和擦毛都会使电极失效。
③电极经长期使用后，电极的斜率和响应速度会降低，可将电极的测量端浸在4%HF中3～5秒钟或稀HCl溶液中1～2分钟，用纯化水清洗之后，在氯化钾（4M）溶液中浸泡使之复新。
5、答：用温度补偿钮以抵消温度的影响，使每一pH间隔相当于一定的伏特数；定位器的作用用来抵偿玻璃电极的不对称电位或其他因素引起的电位偏差，使pH计示数与所测溶液pH值一致。
6、答：无色供试品溶液，检查时的光照度应为1000～1500lx；用透明塑料容器包装或有色供试品溶液，光照度应为2000～3000lx；混悬型供试品为便于观察，光照度为4000lx。
7、答：本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。
8、答：本法系将一定剂量的供试品,静脉滴入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
9、答：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程细菌内毒素检查操作规程一、实验目的细菌内毒素检查是为了检测样本中是否存在细菌产生的内毒素，可以作为细菌感染的诊断依据和治疗效果评估的指标。
二、实验材料和设备1. 细菌培养基和培养物2. 内毒素检测试剂盒3. 显微镜和载玻片4. 离心机5. 温箱和恒温水浴6. 试管、培养皿、移液器等常规实验用品三、实验步骤1. 培养细菌：将待检测的细菌接种到适当的培养基上，放入温箱中以适当的温度和时间进行培养，使细菌生长至对应的生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌转移到离心管中，使用离心机将细菌离心沉淀。
3. 细菌裂解：将细菌沉淀加入合适的裂解缓冲液中，使用适当的方法将细菌完全裂解。
4. 澄清液分离：使用离心机将细菌裂解液离心，将上清液转移到新的试管中。
5. 内毒素检测：按照内毒素检测试剂盒说明书的要求，将所得上清液加入试剂盒中，进行内毒素的检测。
6. 结果解读：根据试剂盒的指示，观察试剂盒中的颜色变化或读取光密度等指标，判断样品中是否存在细菌内毒素。
7. 结果验证：使用正负对照样品验证结果的准确性和可靠性。
四、实验注意事项1. 实验过程需要遵守无菌操作的要求，避免细菌污染。
2. 实验中使用的试剂和培养基要在有效期内，并按照要求保存。
3. 实验过程中应注意个人防护，避免接触到有害物质。
4. 操作前要充分了解试剂盒的使用方法和读取结果的标准。
5. 结果解读时要考虑到阳性和阴性对照的结果，以免误判。
6. 使用的设备要事先进行验证和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。
五、实验结果记录和分析1. 记录实验所使用的试剂批号和有效期。
2. 记录实验过程中的注意事项和操作细节。
3. 记录实验结果，包括阳性和阴性对照的结果。
4. 对实验结果进行分析和解释，判断样品中是否存在细菌内毒素。
六、实验结果的报告和存档1. 编写实验报告，包括实验目的、材料和方法、结果分析、结论等内容。
2. 报告中要附带实验记录、数据分析和结果验证等材料。
6.动态显色法微量技术(mKCA)细菌内毒素检测系统
乳制品2EVERY STEP OF THE WAY。
：0.05ml鲎试剂+0.2ml或0.1ml样品；
高性价比的试剂-（mKCA）鲎试剂
满足GMP和BET法要求
的软件-BioProbe
(生物探针)软件
减少试剂和样品量的
反应容器-微孔反应
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准确稳定的仪器-
ET酶标仪
光程条件下保持高灵敏度，节省资源；
500mL
50mL
动态显色法微
量技术鲎试剂
检测结果定性定量
检测灵敏度0.5~0.015EU/ml；0.01EU/ml;检测范围：10-0.01EU/ml；
加样量0.1ml鲎试剂溶液+0.1ml供试品溶液25 l鲎试剂溶液+25 l供试品溶液
反应时间60分钟一般30-60分钟；最快5分钟可判断结果实验设备37℃恒温设备ET酶标仪、BioProbe软件和计算机
查看结果肉眼观察，人的主观判断为准，容
易误判。
软件自动计算，结果准确；原始数据保存，
可随时分析结果。
数据记录人为记录，对数据完整性形成挑战。
电子数据，原始数据不可修改和删除
22湛江安度斯生物有限公司•“鲎”会有期，让我们一起行动起来保护和你、我一样的献血者-鲎！
谢谢大家！。
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细菌内毒素检查王文洁一、试剂及仪器注射用头孢他啶鲎试剂（λ—标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（BET水），仪器（严格消毒）质量标准：《中国药典》（2005年版）第二部p135细菌内毒素检查法：附录Ⅺ二、实训内容1.细菌内毒素标准溶液的制备15015 1.00.50.250.1250.21.8BET 0.22.8BET 0.90.9BET 0.90.9BET 0.90.9BET 2λλ0.5λ0.25λ2.供试品溶液的制备供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVD＝C×L／λC--为供试品的浓度（当L以EU/ml表示时，C取1.0ml/ml）L--为供试品的细菌内毒素限值，EU／mlλ--鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml ）3.对照PC－阳性对照－－2λ内毒素溶液PPC－供试品阳性对照－－含2λ内毒素溶液的供试品NC－阴性对照－－BET 水4.检查S PC PPC NC各两支将安瓿瓶中溶液轻轻混匀后，封口膜封口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
细菌内毒素检查－－鲎试剂法美国药典近800种药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。
我国药典至2005年版正式收载了需“细菌内毒素检查法”品种达234种。
2005版《中国药典》二部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码甘露醇注射液 2.5 EU/g720.5 EU/ml91右旋糖酐70氯化钠注射液甲硝唑注射液0.35 EU/mg124注射用头孢他啶0.1 EU/mg 135注射用苄星青霉素0.25 EU/1000单位228谷氨酸钾注射液0.012 EU/mg269维生素C注射液 2.5 EU/ml6712005版《中国药典》三部收载的细菌内毒素检查法部分品种表药品名称限值页码乙型脑炎灭活疫苗100EU/微克34人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）100EU/每1次人用剂量95重组乙型肝炎疫苗（酵母）成品10EU/ ml115注射用重组人干扰素γ成品10EU/每1次人用剂量225注射用重组人白介素-2成品10EU/每1次人用剂量227鲎试剂法优点快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品。
鲎试剂法局限性对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。
（鲎变形细胞溶解物）凝固酶内毒素、Ca 2+原理活化的B 因子LAL 中的B 因子凝固酶原凝固原(可凝性蛋白)凝固蛋白（凝固素)凝胶细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法光度测定法:包括浊度法和显色基质法•细菌内毒素检查可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除有专门说明外，以凝胶法结果为准。
概述1.抗生素（antibiotics）在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.分类β–内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星)四环素类(四环素、金霉素、土霉素)大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B)多肽类(多黏菌素、放线菌素)3.来源✓生物合成（发酵）✓化学合成或半合成4.特点✓化学纯度较低✓活性组分易发生变异✓稳定性差5.抗生素质量分析——生物学法、物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差CH 2COHNNSCH 3CH3COOH Oβ–内酰胺类CH COHN NH 2NS CH 3CH 3COOHO氨苄西林CH COHN NH 2HONS CH 3CH 3COOHO阿莫西林青霉素（苄青霉素）（penicillins ）CH COHN NH 2CH 3NOS COOH头孢氨苄CH 3NOS COOHCH COHN NH 2头孢拉定CH 3NOS COOHCH COHN NH 2HO头孢羟氨苄SCH 2CONHNSCH 2COONaCOONa头孢噻吩钠7654321N O NH S CH 2R 1COOH 母核（7-氨基头孢菌烷酸）?RCO 7-aminocephalosporanic acid,简称7-ACA 头孢菌素类N S CH 2R 1COOH O RCONH 12345678N S CH 3CH 3COOH OHN 1234567RCO 母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanic acid,简称6-APA 青霉素类N S CH 3CH 3COOH RCONH O 1234567氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊母核：6－氨基青霉烷酸母核：7－氨基头孢菌烷酸结构与性质1.酸性（羧基）pKa2.5-2.8，酸性较强。
碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。
N SCH3CH3COOKO1234567COHN CH2N SCH3CH3COOHO1234567COHNCH2普鲁卡因2.手性C （旋光性）N S O 1234567N S O 12345678﹡﹡﹡﹡﹡3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4. β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键)干燥条件较稳定，溶液不稳定失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶−−−−−−→−某些氧化剂、金属离子、温度失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类−−−−−→−内酰胺酶-βIdentification(一)色谱法HPLC (t R)TLC (R f)(二)光谱法IR UVCHCOHN N SCH 3CH3COOHO HO NH 2(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH 2OH·HCl NaOH 羟肟酸Fe 3+H +显色2）茚三酮反应——α-氨基茚三酮Δ蓝紫色NS O HN S C NHOH O HN S C O O NH Fe3+/3(红、棕、褐)CH 2NH 2COHN C OHO S N H COONa CH 3CH 3CH 2NH 2COHN C HO N S HCH 3CH 3COONaO Cu(OH)2CNH 2H +O O HO HO C OH O N C O O+C O 2+3H 2O α3）双缩脲反应——β–内酰胺类碱性酒石酸铜紫色CH 2COHNNS O CH 3CH 3COOK H 2SO 4HCHO 变色酸（缩和）显色4）变色酸-硫酸反应5）重氮苯磺酸反应——酚羟基橙黄色重氮苯磺酸−−−→−--OH H C 56（偶合）6）铜盐反应——头孢氨苄的专属反应橄榄绿色−−−→−−−−→−−−→−NaOH 4C uSO HAc7）硫酸-甲醛反应(BP )呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲醛硫酸水湿润−−−→−−−−−→−−−−→−-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)焰色反应——K +、Na +Purity Test (聚合物、有关物质、异构体等)头孢他啶中聚合物测定O O O HO OHCH 2O O O HO OHCH 2OOO HO OHCH 2OOO HOOH CH 2O O HO OHCH 2OO CH 3OH OH OOOCH 2OHHO O O OHO HOO H 2C OO OO OHHO H 2COO H 2C OH HOO CH 2O OO H 2C O OH HOO OO O HO OH CH 2OO CH 2OH HO OO O O CH 2OH HO O OO CH 2OH HO OO O H 2C OH HO O O OCH 2OHHO O O O OO HOHOH 2C OOH 2COHO CH 2OH HO OOH 2C O CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH CH 2CH 2HCOH HCOHCH 2CH 2CH 2HCOH 萄聚糖凝胶立体网状结构图原理——―分子筛”氨基糖苷类氨基环醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)OOCH 2OHHOOHNH 2ONH 2H 2NOOH OCH 2OH HOOR 1R 2OHHOH 2N巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D －核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺OOCRR 1R 2HNONH 2OHONH 2H 2NOHNHCH 3OHCH 3庆大霉素(gentamycin )绛红糖胺(紫素胺)2-脱氧链霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)Identification坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应OONHC NH NH 2HO NH 2CNHNHOHOHOO OHCHOCH 3NH CH 3CH 2OHOHOHN-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan 反应）甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解-−−→−N 乙酰丙酮OH -吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H +红色OONHC NH NH 2HO NH 2CNHNHOHOHOO OHCHOCH 3NH CH 3CH 2OHOHOH 乙酰丙酮OH -对二甲氨基苯甲醛H +N HCOCH 3CH 3HOCH 2(CHOH)3NH 3CH 3CCHN HCOCH 3CH 3N HCOCH 3CH 3麦芽酚反应——链霉糖特有反应紫红色麦芽酚链霉糖链霉素分子重排−−→−−−−→−−−→−+-3OH Fe H+坂口反应——链霉胍特有反应链霉素OH -水解8-羟基喹啉NaOBr或α-萘酚链霉胍橙红色四环素类A BCD123456789101112R R 1R 2R 3HN(CH 3)2OHCONH 2OOH OHOOH结构与性质1）两性：-OH →酸性N(CH 3)2→碱性Ca 2+、Mg 2+生成不溶性盐；Fe 3+形成红色配合物；Al 3+形成黄色配合物；pH3 ~ 7.5多价阳离子与酚二酮→荧光与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度↑2）旋光性3）UV 和荧光4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基)弱酸性（pH2-6）A 环C-4异构化差向四环素酸性（pH <2）C 环脱水脱水四环素碱性C 环开环，形成内酯异四环素5）不稳定性A.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～--−−→←4462pH 蓝色荧光淡黄→黑R 1R 2OHHN(CH 3)2OH CONH 2OOHOHOOHOOH CONH 2(CH 3)2NOHHOOHCONH 2N(CH 3)2HOHAApH2.0~6.0（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）B.酸性脱水降解脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜−−→−2pH λmax = 445nmλmax = 435nmR OHCH 3OHOOHHRCH 3OHOOHRCH 3OHOHOH 2OD D D CBBCBCC.碱性脱水降解)(无活性异四环素四环素−−→−-O HR OHCH 3OH R'''OOH OOH CONH 2NH OH CH 3CH 3CH 3CH 3ROH R'''OO OH CONH 2NH OH O CH 3O OH-技能：掌握采用鲎试剂法—凝胶法进行细菌内毒素检查操作方法掌握根据观察阳、阴性结果判断细菌内毒素检查是否合格的方法相关理论：掌握鲎试剂法检查细菌内毒素的原理掌握细菌内毒素检查的意义熟悉抗生素类药物主要类别及性质。