基因治疗肿瘤的策略(精)

三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。
一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫
通过APC（Antigen Presenting Cells）增强对肿瘤 抗原的识别与呈递。将编码目的抗原的基因，以重组 表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞， 借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子。如通过 主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex， MHC）Ⅰ和/或MHCⅡ类分子抗原处理和 输送途径将抗原信息呈递给T淋巴细胞，从而激发体 液免疫和细胞免疫。
反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基 互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结 合的DNA或RNA，以影响其靶基因的表达，抑 制其功能。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链 RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过 程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关 基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。
第二节 恢复和增强抑癌基因的功能——引入抑癌基因
抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要 的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤 细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代 谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌 细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参 与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌 基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性 的作用。
3.基因修饰（gene augmentation）将目的基因导入病变
细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改 变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强； 4.基因失活（gene inactivation）应用反义核苷酸或核酶特异 的封闭某些致病基因的表达；
区别几个概念：
将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（transfer） 针对宿主细胞叫做转导（transduction）
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Hu Xueyou等合成了MAGE·AL九肽，负载自体 APC后给病人免疫，发现可引起原位和远距离部位的 自体黑色素瘤反应和特异性CTL数量增加，说明此法 可诱导肽特异性CTL应答并进行循环。这一研究结果 为特异性抗黑色素瘤的免疫治疗显示了良好的应用前 景。 免疫基因治疗有助于克服抗癌治疗中碰到的肿瘤 异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难。
体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有： 转导WT、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、 腺癌增殖降低； 转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺 癌增殖降低； 转导wT-1能使裸鼠体内wilms’瘤形成下降；转导 NF1能使神经纤维瘤病病灶减少； 增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。
在研究中人们还发现p16INK4基因正常的癌 细胞株往往都有p53基因异常，p53基因正常的 癌细胞株常有p16INK4基因变异，同时伴随 cyclin D1的过度表达。因此，p16INK4基因与其 它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。
Sandig 等用 p53-p16 重组病毒注射到患肝癌 的小鼠中，肿瘤生长出现逆转，提示了引入抑癌 基因在肿瘤治疗中的前景。
用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺 失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂 导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动 物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性， 从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。 基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研 究阶段。如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体 内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗 方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如 P53、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。
第三节 阻断癌基因功能--反义核酸RNA干扰技术
细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、 myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于 异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞 生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。 因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入 癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法， 阻止癌基因功能。
三、共刺激分子的作用
将MHCⅠ、Ⅱ类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主 免疫系统识别肿瘤细胞为“异己”，以诱发抗肿瘤免疫 反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精 髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白， 又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反 应。Matubonis等研究的结果表明，某些肿瘤细胞APC 表面存在有共刺激分子B7-16（CD80）表达时，更难有 效地激活CTL，基因疫苗激活的CTL具有高度的特异 性和MHC-I类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋 白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体 核酸物质的稳定具有重要意义。
RNAi是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。
有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。 1995年Gou等在对线虫的实验中发现,正义RNA与反 义RNA一样可以阻断par-1基因的表达,但作者对这一 现象没有进行更深入的研究。 1998年, Fire等首次将正义链和反义链的RNA结合物 ———双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)注入 线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要 强得多的基因沉默,每个细胞只要很少几个分子的双 链RNA就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实 验还证实,在线虫体内注入双链RNA,不但可以阻断整 个线虫的所有同源基因的表达,还会导致其第1代子代 的同源基因沉默,他们将这种现象命名为RNAi。此后 ，在多种生物体内陆续发现了RNAi现象,
而这一过程叫做转染（transfection）
目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫 做转化（transformation）
第一节
增强宿主抗肿瘤免疫——肿瘤疫苗的作用
抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方 案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要 包括 一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。 二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。
与传统的基因研究方法 — 基因敲除、定点突变 、反义核酸及核酶技术等相比 ，RNAi具有以 下五大特点：
基因序列特异性； dsRNA的稳定性； 沉默信号传递性； Knock-down高效性； RNAi效用浓度依赖性。
一、RNAi的分子机制 外源性(如病毒) 或内源性的dsRNA 在细胞内与一种 RNA 酶Ⅲ(RNAase Ⅲ核酸内切酶) Dicer 结合,随即被切割成 21～23nt 的带有3’端单链尾巴及磷酸化5’端的短链dsRNA , 即小干扰RNA（small interfereing RNA,siRNA）。siRNA 与Dicer 形成RNA引导沉默的复合体(RNA induces silencing comple ,RISC) 。siRNA 作为引导序列,按照碱基互补原则识 别靶基因转录出的mRNA , 并引导RICS 结合mRNA。随后 siRNA与mRNA 在复合体中换位,核酸酶Dicer 将mRNA 切割 成21～23nt 的片段,特异性地抑制靶基因的表达。而新产生 的dsRNA 片段可再次形成RISC ,继续降解mRNA ,从而产生 级联放大效应。因此,每个细胞只需要几个siRNA 分子就能 够引起强烈的RNAi 效应。此外, siRNA 还可以在RNA 依赖 性RNA 聚合酶(RNA dependentRNA polymerase ,RdRp) 的 作用下进行大量扩增,并转运出细胞,使RNAi 扩散到整个机 体并可以传代。
许多学者认为,在生物中广泛存在的PTGS现象可视作不 同物种所共有的适应保护机制: 通过阻抑大量的异常mRNA表达,抵抗转座子和病毒的侵袭 ,以保护机体免于受损,相当于基因组的免疫系统；
通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。
RNAi 在哺乳动物中的研究主要集中在干扰病毒在体内的 复制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方 面。
在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引 起的DNA损伤有重要的作用,可引起细胞周期停 滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。 自从1994年Okamato等构建含有p16INK4cDNA 的表达载体pCMV-p16，成功地转染p16INK4基 因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系 SKOV-3，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使 瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部 癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除 P53的突变，取得一定的疗效。
Nakamura等用野生型P53肿瘤抑制基因替代 疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成 功，还有待于临床阶段的进一步工作证明。 Schrump等对食管鳞状细胞癌系， Fueyo、 Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行 p16INK4基因替代治疗研究，证明p16INK4基因 的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的 研究发现，这种抑制作用是有选择的，对Rb基因 缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑 制作用。
应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在， 特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导 的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织。以 往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始， 然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个 原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿 瘤特异性肽的CTL，再通过CTL寻找其编码肽 的基因。通过这种方法，发现了黑色素瘤基因 MAGE-1，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的 特异性T细胞所识别。
二、细胞因子的免疫基因治疗
将IL-1、IL-4、TNFα、IFN等细胞因子基因导入肿 瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发CD4+毒性 T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte ，CTL)反应，而导致 分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。
如Shiau等在体内给予表达干扰素-γ的逆转录病毒进行 鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗,其目的是增加肿瘤细胞在 局部产生干扰素-γ,以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。 这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用， 这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性Ｔ细胞（Helper T Lymphocyte ，TH）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有 抑制作用。
基因治疗肿瘤的策略
南通大学基础医学院 陈 莉
肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗 最引人瞩目的研究领域，是继手术、 放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种 模式,是肿瘤治疗的有益补充。 基因治疗就是用正常或野生型基因校 正或置换致病基因的一种治疗方法。
基因治疗的基本程序：
1.目的基因准备； 2.受体细胞（靶细胞）培养； 3.载体的选择与克隆；
4.将目的基因导入靶细胞；
5.转导细胞的选择和鉴定； 6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。
基因治疗的主要措施有：
1.基因置换（gene replacement）将致病基因整个的换以 正常基因，使致病基因永久的得到更正； 2.基因修正（gene correction）将基因的突变碱基序列 纠正，而正常部分给予保留；
将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte ，TIL）和淋巴因子激活的杀伤性 细胞（Lymphokine Activated Killer cell ，LAK细胞），使 之活化，活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内 后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤 免疫的细胞因子基因产物。 Hull等比较了伴有IL-12和共刺激分子B7-1（AdmIL12/B7） 两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7（AdmIL-12） 表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的RM-9鼠前列腺癌模 型，研究发现在感染的RM-9鼠肿瘤细胞中AdmIL-12/B7能 介导IL-12分泌和增加B7-1在细胞表面的表达,通过在比较 体内注射AdmIL-12/B7、AdmIL-12和对照组的疗效比较显 示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。使用两 个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4+CD8+ 的免疫反应细胞。