基因治疗肿瘤的策略(精)

第二节 恢复和增强抑癌基因的功能——引入抑癌基因
抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要 的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤 细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代 谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌 细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参 与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌 基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性 的作用。
三、共刺激分子的作用
将MHCⅠ、Ⅱ类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主 免疫系统识别肿瘤细胞为“异己”，以诱发抗肿瘤免疫 反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精 髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白， 又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反 应。Matubonis等研究的结果表明，某些肿瘤细胞APC 表面存在有共刺激分子B7-16（CD80）表达时，更难有 效地激活CTL，基因疫苗激活的CTL具有高度的特异 性和MHC-I类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋 白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体 核酸物质的稳定具有重要意义。
许多学者认为,在生物中广泛存在的PTGS现象可视作不 同物种所共有的适应保护机制: 通过阻抑大量的异常mRNA表达,抵抗转座子和病毒的侵袭 ,以保护机体免于受损,相当于基因组的免疫系统；
通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。
RNAi 在哺乳动物中的研究主要集中在干扰病毒在体内的 复制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方 面。
基因治疗肿瘤的策略
南通大学基础医学院 陈 莉
肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗 最引人瞩目的研究领域，是继手术、 放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种 模式,是肿瘤治疗的有益补充。 基因治疗就是用正常或野生型基因校 正或置换致病基因的一种治疗方法。
基因治疗的基本程序：
1.目的基因准备； 2.受体细胞（靶细胞）培养； 3.载体的选择与克隆；
用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺 失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂 导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动 物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性， 从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。 基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研 究阶段。如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体 内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗 方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如 P53、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。
在研究中人们还发现p16INK4基因正常的癌 细胞株往往都有p53基因异常，p53基因正常的 癌细胞株常有p16INK4基因变异，同时伴随 cyclin D1的过度表达。因此，p16INK4基因与其 它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。
Sandig 等用 p53-p16 重组病毒注射到患肝癌 的小鼠中，肿瘤生长出现逆转，提示了引入抑癌 基因在肿瘤治疗中的前景。
而这一过程叫做转染（transfection）
目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫 做转化（transformation）
第一节
增强宿主抗肿瘤免疫——肿瘤疫苗的作用
抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方 案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要 包括 一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。 二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。
RNAi是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。
有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。 1995年Gou等在对线虫的实验中发现,正义RNA与反 义RNA一样可以阻断par-1基因的表达,但作者对这一 现象没有进行更深入的研究。 1998年, Fire等首次将正义链和反义链的RNA结合物 ———双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)注入 线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要 强得多的基因沉默,每个细胞只要很少几个分子的双 链RNA就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实 验还证实,在线虫体内注入双链RNA,不但可以阻断整 个线虫的所有同源基因的表达,还会导致其第1代子代 的同源基因沉默,他们将这种现象命名为RNAi。此后 ，在多种生物体内陆续发现了RNAi现象,
与传统的基因研究方法 — 基因敲除、定点突变 、反义核酸及核酶技术等相比 ，RNAi具有以 下五大特点：
基因序列特异性； dsRNA的稳定性； 沉默信号传递性； Knock-down高效性； RNAi效用浓度依赖性。
一、RNAi的分子机制 外源性(如病毒) 或内源性的dsRNA 在细胞内与一种 RNA 酶Ⅲ(RNAase Ⅲ核酸内切酶) Dicer 结合,随即被切割成 21～23nt 的带有3’端单链尾巴及磷酸化5’端的短链dsRNA , 即小干扰RNA（small interfereing RNA,siRNA）。siRNA 与Dicer 形成RNA引导沉默的复合体(RNA induces silencing comple ,RISC) 。siRNA 作为引导序列,按照碱基互补原则识 别靶基因转录出的mRNA , 并引导RICS 结合mRNA。随后 siRNA与mRNA 在复合体中换位,核酸酶Dicer 将mRNA 切割 成21～23nt 的片段,特异性地抑制靶基因的表达。而新产生 的dsRNA 片段可再次形成RISC ,继续降解mRNA ,从而产生 级联放大效应。因此,每个细胞只需要几个siRNA 分子就能 够引起强烈的RNAi 效应。此外, siRNA 还可以在RNA 依赖 性RNA 聚合酶(RNA dependentRNA polymerase ,RdRp) 的 作用下进行大量扩增,并转运出细胞,使RNAi 扩散到整个机 体并可以传代。
二、细胞因子的免疫基因治疗
将IL-1、IL-4、TNFα、IFN等细胞因子基因导入肿 瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发CD4+毒性 T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte ，CTL)反应，而导致 分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。
如Shiau等在体内给予表达干扰素-γ的逆转录病毒进行 鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗,其目的是增加肿瘤细胞在 局部产生干扰素-γ,以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。 这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用， 这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性Ｔ细胞（Helper T Lymphocyte ，TH）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有 抑制作用。
体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有： 转导WT、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、 腺癌增殖降低； 转导Rb基因lms’瘤形成下降；转导 NF1能使神经纤维瘤病病灶减少； 增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。
应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在， 特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导 的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织。以 往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始， 然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个 原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿 瘤特异性肽的CTL，再通过CTL寻找其编码肽 的基因。通过这种方法，发现了黑色素瘤基因 MAGE-1，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的 特异性T细胞所识别。
将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte ，TIL）和淋巴因子激活的杀伤性 细胞（Lymphokine Activated Killer cell ，LAK细胞），使 之活化，活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内 后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤 免疫的细胞因子基因产物。 Hull等比较了伴有IL-12和共刺激分子B7-1（AdmIL12/B7） 两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7（AdmIL-12） 表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的RM-9鼠前列腺癌模 型，研究发现在感染的RM-9鼠肿瘤细胞中AdmIL-12/B7能 介导IL-12分泌和增加B7-1在细胞表面的表达,通过在比较 体内注射AdmIL-12/B7、AdmIL-12和对照组的疗效比较显 示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。使用两 个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4+CD8+ 的免疫反应细胞。
Nakamura等用野生型P53肿瘤抑制基因替代 疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成 功，还有待于临床阶段的进一步工作证明。 Schrump等对食管鳞状细胞癌系， Fueyo、 Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行 p16INK4基因替代治疗研究，证明p16INK4基因 的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的 研究发现，这种抑制作用是有选择的，对Rb基因 缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑 制作用。
第三节 阻断癌基因功能--反义核酸RNA干扰技术
细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、 myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于 异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞 生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。 因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入 癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法， 阻止癌基因功能。
4.将目的基因导入靶细胞；
5.转导细胞的选择和鉴定； 6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。
基因治疗的主要措施有：
1.基因置换（gene replacement）将致病基因整个的换以 正常基因，使致病基因永久的得到更正； 2.基因修正（gene correction）将基因的突变碱基序列 纠正，而正常部分给予保留；
3.基因修饰（gene augmentation）将目的基因导入病变
细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改 变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强； 4.基因失活（gene inactivation）应用反义核苷酸或核酶特异 的封闭某些致病基因的表达；
区别几个概念：
将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（transfer） 针对宿主细胞叫做转导（transduction）