磷酸化蛋白质组学的研究及其应用

磷酸化蛋白质组学的研究及其应用

郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法及其在生命领域的应用前景。

关键词：蛋白质；磷酸化；翻译；方法；检测

在对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物开发研究中，往往需要获取一些高通量、大样本、全局性数据，通过整体化系统性分析，从中寻找线索，推断可能的病因以及诊断靶标，由此诞生了诸如基因组学、蛋白质组学及代谢组学等建立在网络架构式研究思路基础上多种新的研究方法和理论。生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应,这些反应过程靠复杂的调控机制调节,

其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的[1]。目前,已发现20多种蛋白质翻译后修饰,以至一种基因产物可呈现磷酸化修饰、糖基化修饰、羧基化修饰、乙酰化修饰以及连接变异体等多种形式[2]。

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性,以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程,并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式[3]。目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[4]。

磷酸化蛋白质组学的研究尚处于初期阶段，鉴于其特殊的研究方法及内容，对揭示生命体尤其是疾病状态下细胞信号传导具有不可替代的优势[5-7]。此外，

磷酸化蛋白质组学的研究为寻找药物新的作用靶点和疾病诊断指标提供全新的

研究思路。本文就磷酸化蛋白质的检测、定量技术及其在生物领域的研究进行综述。

1.蛋白质磷酸化研究概况

蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。在真核生物中常见的三种磷酸化形式,丝氨酸磷酸化最多,苏氨酸磷酸化次之,而酪氨酸磷酸化最少,三者的比例是1800∶200∶1[8]。丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的磷酸化是非常重要的蛋白质功能调节器[9],正确解析磷酸化蛋白质的结

构以及为磷酸化的位点是磷酸化蛋白质组的主要任务之一。另外,蛋白质磷酸化在机体内是动态的过程,不同条件下蛋白质磷酸化的定量分析是差异蛋白质组学研究的重要内容。

2.磷酸化蛋白质的主要检测技术

2.1放射性标记法

放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法,是将用放射性同位素P标记的磷酸化蛋白质,经分离、富集后,利用放射自显影技术进行磷酸化蛋白质的检测。若要进一步分析磷酸化位点,则需要通过蛋白酶解消化,再通过Edman降解或质

谱对肽段进行测序。此方法具有直接、灵敏度高的特点。但由于存在有放射性污染;磷酸化、脱磷酸化的速率易受多种因素包括孵育时间等的影响;磷酸化、脱磷酸化变化慢而管家蛋白质的磷酸化不易测出,不能进行组织标记等局限性,故极大地限制了它的应用[10]。

2.2免疫印迹与免疫沉淀法

此法是将蛋白质电泳分离后,用抗磷酸化氨基酸抗体与磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检出磷酸化蛋白质的较为常用的分析方法。由于抗丝、苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇较小,使得抗原抗体的结合位点存在空间障碍,特异性较差。所以很少被用来进行免疫印迹反应。抗酪氨酸磷酸化抗体特异性较好,也最为常用。由于磷酸化蛋白质含量很低,如果先用免疫沉淀对磷酸化蛋白质进行富集,这样可以降低非磷酸化蛋白质的干扰,提高检测的准确性。随着抗体制备技术的改进,也有研究人员已经尝试用类似方法对丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质进行研究。但是该方法也存在一定的局限性,如多检出高丰度蛋白质,需要大量的样品,抗体并非绝对专一性[11],许多非磷酸化蛋白质会出现假阳性结果。

2.3荧光检测法

Pro—Q Diamond是Molecular Probes公司近年新推出的一种磷酸化蛋白质的荧光染料。通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质,而对非磷酸化蛋白质的反应性很低,且荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化,在500～1000倍浓度范围内荧光染色的线性反应实现严格定量改变[12]。因此可用于磷酸化蛋白质的差异表达谱方面的研究。另外该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用,进行磷酸化蛋白质的定量。其缺点是对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度不同,不能检测出体内所有的磷酸化蛋白质。

3.磷酸化蛋白质的鉴定

质谱技术是鉴定蛋白质的最基本手段,目前多采用质谱为基础的多种技术相结合的鉴定方法。在串联质谱仪的前体离子扫描、中性丢失扫描等阴、阳离子模式下,磷酸肽经碰撞诱导解离(collision—induced dissociation,CID)产生的特异性片段,分别丢失80Da(HPO3)和98Da(H3PO)的子离子,检测所产生的全部碎片离子,根据碎片离子质量数来推断肽段序列和磷酸化位点。此法已成功的用于ECG信号传导通路中磷酸肽的鉴定。优点是高选择性、高灵敏度。但由于受极性的影响不适合于联机使用。电子捕获解离(electron capture dissociation ,ECD)结合傅立叶交换离子回旋加速共振(Fourier transforlm ion cyclotron resonance.F-ICR)质谱是最新发展的鉴定磷酸化蛋白质的技术。该技术因可对酶切消化的肽骨架进行测序,保留磷酸化氨基酸的完整性,从而可以绘制出磷酸化蛋白质的真实谱图。

4.磷酸化蛋白质定量

4.1稳定同位素标记法

用15N、14N分别标记细胞蛋白质后混合培养,提取细胞蛋白,分离磷酸化蛋白质,酶解,最后进行质谱分析。通过比较MS图中15N和14N峰的强度比进行磷酸化程度的相对定量。这一方法需要在标记培养基中培养细胞,培养基的差异本身就有可能造成蛋白质表达量的变化,而且目标蛋白质需要纯化、分离,所以还不能用于大规模的蛋白质定量分析。

4.2同位素亲和标签(ICAT)法

ICAT技术是利用两种不同的磷酸化蛋白同位素亲和标签试剂