07第七章 亲和层析

•
•
(1)直接测定法 ①2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 ②根据配体的特性进行测定 (2)间接测定法
①推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止， 根据上样量即可推算出配体的结合量。
因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种 基质。
二、配体的选择 可选择的配体有： 抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金 属离子)等。
优良的配体须具备两个条件： 1）与纯化的物质有较强亲和力 一般来说， 配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或 Ka（解离常数） 较小)，在亲和层析中应用的价值就 越大。 2）具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没 有影响或影响不明显。 就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理 在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当 长 度 的 “ 手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架， Байду номын сангаас许可以 减少基质的立体位阻 效应， 增加配体的活动度 , 伸入溶液的深度, 从而提高吸附剂的操作 容量。

亲和层析法 根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的 层析方法，称为亲和层析法(affinity chromatography)。
亲和层析的原理(见图7-1)：
• 每对反应物之 间都有一定的 亲和力。 正如在酶与底物 的反应中，特 异的底物(S’)才 能和一定的酶 (E)结合，产生 复合物(E-S’)一 样。 • 在亲和层析中 是特异的配体 才能和一定的 生命大分子之 间具有亲和力， 并产生复合物。

例如, 用对氨基苯-ß -D-硫代吡喃半乳糖苷作为配体纯化ß -半 乳糖苷酶时， 如果把配体直接连于Sepharose 4B上所产生的衍生物A， 则不能吸附ß-半乳糖苷酶。 当Sepharose上引入氨乙基乙酰胺或引入 3，3’- 二氨基二丙胺琥珀酰胺再接配体时，所产生 的衍生物B和C(图7-8 B、C)都能吸附ß-半乳糖苷酶。 从衍生物A、B、C来看，随着手臂的增长，吸附能力 也增加了。 但是，并非越长越好，若过长，则有可能发生“手臂” 折叠弯曲，从而导致吸附容量降低。
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度 对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。 增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相 应增加(见表7-5)。
层析分离过程： • 样品过柱时， 样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、 范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载 体上; 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出 来，并形成了第一个层析峰； • • 然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH值、 或增加离子强度、 或加入抑制剂等因子， 即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰(见图7-2B)。
六、亲和层析柱的再生 当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐 溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重 新平衡。 经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层 析。 一般亲和层析柱都可以反复使用多次。
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量， 与它们之间的亲和力有密切关系， 还与样品的pH值和离子强度有关系。
五、分离大分子物质（洗脱） 除去杂质 样品过柱后， 可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和力的杂蛋 白， 有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之； 最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。 洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲 和力决定：
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
第二节 操
作
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响；
第一节 基本原理
M-L-S复合物 欲分离的大分子物质S 与相对应的专一物质L(配体)以次级键结合（亲和 力）， 能生成一种可解离的络合物L-S， 其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合， 而形成M-L-S复合物。 亲和吸附剂 配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M 上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
图7—8 纯化ß -半乳糖苷酶的吸附剂
2．吸附剂衍生物的制备 构成“手臂”最多的方法： • 首先，把适当长度的氨基化合物共价结合到用溴化氰 活 化 的 琼 脂 糖 上 ， 制 成 十 分 稳 定 的 衍 生 物 ( 即 AHSepharose和CH-Sepharose) （常用的氨基化合物是1， 6-己二胺和6-氨基己酸。） • 在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含 羟基或氨基的任何化合物结合成固相载体。 • 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
通过活化反应形成的化合物可能有两种： • 其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物； • 其二是无反应能力的氨基碳酸盐。
2．偶联 配体和基质充分偶联而形成固相载体。
经活化和洗涤过的基质与等体积的0.2~0.25mol／L碳 酸盐缓冲液(含0.5mol／LNaCl和1~10pmol配体／ml基 质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温)或 过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载体。
溴化氰偶联法 主要包括： • 1.活化 • 2.偶联 • 3.除去未结合的配体 • 4.配体结合量的测定等步骤。
1．活化基质
• 在一定量的贮存基质Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加 入等量的蒸馏水和2mol／L Na2C03溶液(pHll~12)，混匀。 • 另将称量的固体CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。 • 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的预冷 水及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定： • 当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可 提高结合容量； • 当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基 质对改善分离效果有利。 一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺 凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻 璃珠。
图7-4是植物血球凝集素(如Con· A)-Sepharose4B亲和 吸附剂的制备流程(供参考)。
3．配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体 的量表示的。如用mg／m1表示。 测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量 的参数。 具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
四、特异性吸附 大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程
如图7-5所示
当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱(A)时， 欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；
当样品开始进入柱中时， 配体和欲分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，但也 有部分复合物分解； 当样品不断地通过柱子时， 欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。 也就是说，随着样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质的浓 度会恒定地增加(B)。 由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻碍，从而导致 产生紧密的复合物带(C)。
第七章 亲和层析
一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的 主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。 缺点： 由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物 质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终 收得率却甚低。
1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成 功地制备了固定化酶。 这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯 化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐 步得到了广泛的应用。 这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速 和高效(见表7-1)。
三、亲和吸附剂的制备 把配体偶联到基质上的方法有两类： 物理的（如包埋法和吸附法等） 化学的（如偶联法和交联法等）
交联法： 是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基质和配体。 偶联法： 常用的化学试剂有： 溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二 乙酸等， 用其活化的基质与配体偶联，或者用其把基质与配体螯合起来
相比之下，实践中应用较多的基质是： 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、 多孔性玻璃珠、 琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B
• Sepharose • 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；
• 它基本上能符合理想基质的五点要求； • 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的 基团； • 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大 分子物质，且吸附容量也较大； • 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械 强度比Sepharose 2B好。